| 研究課題/領域番号 |
19K05792
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| 研究機関 | 岡山大学 |
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研究代表者 |
神崎 浩 岡山大学, 環境生命科学研究科, 教授 (60183787)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | β-N-アセチルグルコサミニダーゼ / TMG-chitotriomycin / PNP-TMG / β-GlcNAcase |
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| 研究実績の概要 |
糖質加水分解酵素(GH)には同じファミリーに属しながら， Subsiteによる基質認識機構が異 なる酵素が知られている。GHの基質認識機構の多様性を詳細に明らかにするには，ユニークな基質認識機構を有する新奇なGHを見出すことが重要である。 我々は，β-N-Acetylglucosaminidaseの阻害剤TMG-chitotriomycinを発見し、TMG(Trimethylglucosaminium)残基が阻害活性に重要で、PNP(p-Nitrophenyl)-TMGも阻害を示すことを明らかにした。 今回、TMG阻害剤に対して既存酵素と異なる阻害特異性を示す酵素を生産する微生物の獲得を目指した。
自然界から単離したPNP-GlcNAc資化性菌27株を，ブイヨン培地およびpNP-GlcNAc培地で培養し，休止菌体のPNP-GlcNAc分解活性を測定したところ、ブイヨン培地を用いて培養したとき，全ての菌株においてpNP-GlcNAc分解活性が確認されたことからGlcNAcaseを構成的に発現していると推測された。
また、両培地でβ-GlcNAcaseを高生産するMK26株の， PNP-GlcNAc含有培地で生産される酵素(β-GlcNAcase-M K26-pGN)は，ブイヨン培地で生産される酵素(β-GlcNAcase-MK26-Bouillon)と異なり，タンパク質の疎水性が高く，界面活性剤存在下で抽出液 中に活性が回収された。1つの菌株が2種の 特性の異なるβ-GlcNAcaseを生産することは大変興味深い。
β-GlcNAcase-MK26-Bouillonについて、イオン交換及びゲル濾過クロマトグラフィー で部分精製し、その部分精製酵素についてTMG-chitotriomycin、PNP-TMGに対する阻害特異性を検討したところ、既存酵素と異なっていることが判明した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
① β-GlcNAcase高生産 PNP-GlcNAc資化性菌からの酵素の精製と諸性質検討についてはβ-GlcNAcase-MK26-Bouillonの精製を中心に現在進めており、酵素の精製は順調に進行しており、活性量の多い酵素をまず精製し、その諸性質、特に阻害剤特異性を検討することにしている。本研究の目的の一つである、阻害剤特異性について、部分精製酵素で興味深い予備的な結果が得られている。
② PNP-TMG資化性菌の取得とその菌株のβ-GlcNAc分解酵素の精査については、PNP-TMGの微生物に対する毒性の高さから、涵養培養に時間を要することが判明した。
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| 今後の研究の推進方策 |
β-GlcNAcase-MK26-Bouillonとして複数存在する酵素のうち、酵素量の多い酵素について、電気泳動的に単一精製を目指し、その酵素の諸性質、特に阻害剤特異性を明らかにし、これまでに報告されているβ-GlcNAcaseとの比較を詳細に行う。また、β-GlcNAcase-MK26-Bouillonとして複数存在する酵素のうち、酵素量の少ない酵素についても、培養量を増やし、より多くの菌体から精製を同様に試み、諸性質を精査する。
PNP-TMG資化性菌の取得については、涵養培養の期間をより長くし、さらに培地成分の検討も加えつつ、PNP-TMG能力の高い菌株の獲得を目指す。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
COVID19のため、発表予定学会が中止となり、予定の旅費を使用しなかったため。
なお、2020年3月5日付けで大会講演要旨集（PDF）が発行され、大会ホームページ上への掲載をもって発表が成立しており、この報告書にその成果も記載している。
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