| 研究課題/領域番号 |
19K05796
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| 研究機関 | 石川県立大学 |
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研究代表者 |
河井 重幸 石川県立大学, 生物資源環境学部, 教授 (00303909)
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| 研究分担者 |
橋本 渉 京都大学, 農学研究科, 教授 (30273519)
三沢 典彦 石川県立大学, 生物資源環境学部, 教授 (30393466)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 油脂蓄積酵母 / Yarrowoa lipolytica / バレリアノール / 油脂 / 褐藻 / アルギン酸 / DEH |
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| 研究実績の概要 |
本研究の目的は、①油脂蓄積酵母（Yarrowoa lipolytica: Yli酵母）におけるHMG-CoAレダクターゼ（Yli酵母Hmg1）のリン酸化による活性制御機序を解明すること、②同機序に基づいてバレリアノールを高生産するYli酵母を構築すること、および③アルギン酸と硝酸塩からバレリアノールを高生産するYli酵母と油脂を高生産するYli酵母を構築することである。
当該年度は、①②に関しては、Yli酵母Hmg1の推定リン酸化部位（Ser-973とThr-977）を各々Alaに置換したHmg1_TA（Ala置換により細胞内でリン酸化されなくなると予想）ならびにYli酵母Hmg1を発現させるプラスミド、またはコントロール（ベクター）を保有するバレリアノール生産Yli酵母（前年度に構築）の生産するメバロン酸をHPLCで定量することで、これらのAla置換がHmg1活性に及ぼす効果を検証した。その結果、コントロールと比較して、メバロン酸量は増加していなかった(むしろ2割ほど低下していた)。すなわち、Ala置換には効果が無いことが分った。また、油脂合成経路の弱化による方法でもバレリアノールの高生産を試みるため、ターゲット遺伝子（Yli酵母ではylAcc1）の上流域（-550, -442, -135, -10の各々）をターゲットとするSTEPS法のプラスミドを保有する上記バレリアノール生産Yli酵母のメバロン酸量を定量したところ、-10領域をターゲットとした場合のみコントロール（pCRISPRy_Mix_yl）と比較してメバロン酸生産量が1.8倍増大していた。③に関しては、前年度構築したDEH資化能を示すYli酵母（Yli_DEH+株）の培養条件（使用窒素源）の選定、蛍光試薬Bodipy493／503を用いた油脂蓄積の可視化、生産された油脂のGC-MSによる分析を行った。ただし、適応進化によるDEH資化能の向上には至らなかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
①②に関しては、Hmg1のAla置換が効果が無いことが分ったものの、-10領域をターゲットとするSTEPS法が有望である可能性が示されたためかかる評価とした。
③に関してはYli_DEH+株）の培養条件（使用窒素源）の選定、蛍光試薬Bodipy493／503を用いた油脂蓄積の可視化、生産された油脂のGC-MSによる分析を進めた点を鑑み、かかる評価とした。
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| 今後の研究の推進方策 |
①②に関して、-10領域をターゲットとするSTEPS法でメバロン酸分泌量が確かに増加していることを確認し、確証できればバレリアノール生産量が向上しているかをGC-MSで分析する。
③に関しては、DEHから合成された油脂の成分および量を、グルコースからの場合と比較しつつGC-MSで明らかにする、DEHとグルコースの消費速度を比較する、pex10の破壊、DGA1の大量発現、Leu2、Ura3の発現等で油脂生産量を向上させる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当該助成金が生じた状況１:設置予定であった（１）ブロッティング装置を設置しなかった。
翌年度分として請求した助成金と合わせた使用計画：（1）は設置予定。他は、特に物品費として油脂、バレリアノールの分析や遺伝子操作に要する主に物品費として援用し、目的達成に万全を期す。
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