| 研究課題/領域番号 |
19K05798
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| 研究機関 | 滋賀県立大学 |
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研究代表者 |
竹原 宗範 滋賀県立大学, 工学部, 講師 (30275169)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 塩基性ポリペプチド / ポリ(ε-L-リシン) / ポリ(γ-L-ジアミノ酪酸) / 抗菌性 / 環境応答 / シデロフォア / クオラムセンシング |
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| 研究実績の概要 |
本研究は抗菌性の塩基性アミノ酸のポリマーであるポリ(ε-L-リシン)（ε-PL）の放線菌による「準普遍的」な生産に着目し，ε-PLおよびその類縁化合物の生産と機能に関する生物学的意義を明らかにするとともに，当該ポリマーの新機能性分子としての利用展開の礎を築くことを目的としている。本実験計画では，ε-PLおよびその類縁体であるポリ(γ-L-ジアミノ酪酸)（γ-PAB）およびポリ(ジアミノプロピオン酸)（PAP）について，抗菌剤としての役割を再考するとともに，環境応答に関わる分子としての性質を調査する。次の検討項目について，2019年度に得られた成果を報告する。
i) PAPの構造決定： PAPのモノマー単位であるジアミノプロピオン酸の光学異性体比（D,L-比）を決定した。PAPの酸加水分解により生じるモノマーは完全にラセミ化されることから，本実験ではPAPの酵素による分解を検討した。プロテアーゼA「アマノ」SDによる処理で生じたアミノ酸モノマーをキラルHPLCで解析したところ，L-プロパン酸のみが検出された。プロトンおよび13C NMRによる構造解析結果と合わせて，PAPをポリ[β-(N-α-L-ジアミノプロピオニル-L-ジアミノプロピオン酸)]と決定した。
ii) 塩基性ポリペプチド生合成遺伝子のノックアウト体の作製とpH感受性試験： 申請当初は2020年度に実施予定であった本項目について，一部前倒しで2019年度内に実施した。ε-PLおよびγ-PABを併産する放線菌株において，属間接合ベクターを利用した相同組換えの手法により，ε-PL生合成遺伝子あるいはγ-PAB生合成遺伝子を欠損した2種の変異株を得た。2020年度は引き続いて，これら両変異株の酸性環境下における生育能を野生株と比較し，環境ストレスに対する耐性を議論する。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
上記の「研究実績の概要」に示すように「i) PAPの構造決定」については，当初の計画通り，これを遂行し，目標を達成できた。現在，“Novel basic poly(amino acid) coproduced with poly(ε-L-lysine) by a strain of Streptomyces sp.: isolation and characterization of diaminopropionic acid homopolymer”というタイトルの論文の投稿準備中である。
当初計画ではこれに引き続いて「iii) 塩基性ポリペプチドの抗菌性の相加/相乗効果の検定」を実施予定であったが，これまでポリペプチドの精製に用いていた限外ろ過膜の製品規格に変更があったため，従前の取扱いでは，所定量のポリペプチドを取得できない状況に陥った（具体的には，分子量の小さい画分がろ過膜を通過してしまうようになった）。限外ろ過膜を用いない精製方法の再確立に時間を費やすことになったため，「ii) 塩基性ポリペプチド生合成遺伝子のノックアウト体の作製とpH感受性試験」を，連携研究者の山中一也准教授（関西大学 化学生命工学部）の協力を得て，前倒しして着手することに変更した。2020年度はこれにより得られたε-PL生合成遺伝子あるいはγ-PAB生合成遺伝子を欠損した2種の変異株について，酸性環境下における生育能を野生株と比較し，環境ストレスに対する耐性を議論する。加えて，「iii) 塩基性ポリペプチドの抗菌性の相加効果と相乗効果の検定」を改めて検討する。
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| 今後の研究の推進方策 |
ε-PL生産は特定の放線菌に限定される「特異的」なポリペプチドであると考えられてきたが，我々は数多くの放線菌がε-PLを生産しており，その構成アミノ酸や重合度に多様性があることを見出した。また，ε-PLは食品保存剤にも利用される「マイルド」な抗菌剤であり，典型的な抗生物質とは異なる生物学的役割を環境中で担っていると考えられる。2020年度は以下の研究計画に従う。
ii) 塩基性ポリペプチド生合成遺伝子のノックアウト体の作製とpH感受性試験（継続）： 塩基性ポリペプチドは菌体が強酸性下に曝された時に生産され，またpHが中性に復帰した時には自らが生産する分解酵素に速やかに消化される。つまり酸性下ではポリペプチドを菌体表層に「まとう」ことでpH恒常性を維持していると考えられる。本年度は，既に作成した変異体について，酸性環境下における生育能を野生株と比較しながら評価する。
iii) 塩基性ポリペプチドの抗菌性の相加/相乗効果の検定： 分離したいくつかのε-PL生産株はγ-PABあるいはPAPを併産する。真正細菌および酵母を被検菌として，任意の割合で混合したこれらポリペプチドの最小発育阻止濃度を測定し，Fractional inhibitory concentration indexを求め，それらの抗菌活性発現における相加/相乗効果を評価する。
iv) ε-PLの菌体密度依存的生産： 一部の細菌では同種の菌体密度をシグナル分子濃度から感知し，物質の生産を制御するクオラムセンシング機構が備わっている。いくつかのε-PL生産菌は高密度生育環境下でε-PL生産を抑制するという負の生産制御が行なわれていた。当該年度は，新型コロナウイルス感染症対策の実施による研究活動期間の短縮を考慮し，まずは，ブチロラクトン誘導体が濃度依存的にペプチド生産制御に関与しているか予備検討のみ実施する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
上述のように実験項目「ii) 塩基性ポリペプチド生合成遺伝子のノックアウト体の作製とpH感受性試験」を2019年度に前倒しで実行し，代わりに実験項目「iii) 塩基性ポリペプチドの抗菌性の相加/相乗効果の検定」を2020年度にシフトするような計画順の変更を行ったため，148,423円分を2020年度に繰越して執行することとした。すなわち，著量のポリペプチド分離・精製に用いる比較的高価な消耗品類（クロマトグラフィー用エンプティカラム [Cytiva KX 26/40]，弱陽イオン交換樹脂 [東ソー Toyopearl GigaCap CM650M]）の購入にかかる費用を2020年度に持ち越した。
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