| 研究課題/領域番号 |
19K05817
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| 研究機関 | 札幌医科大学 |
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研究代表者 |
甲斐 正広 札幌医科大学, 医学部, 講師 (80260777)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | ジアシルグリセロールキナーゼ / メラノーマ / N FκB |
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| 研究実績の概要 |
初年度は主にヒト悪性黒色腫（メラノーマ）におけるジアシルグリセロールキナーゼγ(DGKG)の機能について検討した。
準備段階において明らかにされた知見の一つが、DGKGの不活性型ミュータント(KD, kinase-dead)あるいは常時活性化型ミュータント(CA, constitutively active)のどちらを発現しても、メラノーマ細胞の遊走能や浸潤能が同様の影響を受けるということであった。そのメカニズムを解明するためにマイクロアレイ解析を行ったところ、DGKG-KDまたはDGKG-CAのどちらかを過剰発現したメラノーマ細胞において、両者ともにNFκB関連遺伝子の発現に対して有意に影響を与えることがわかった。実際に定量PCR法を用いてNFKB1遺伝子の発現量を調べてみると、使用した３種のメラノーマ細胞株のうち１株ではKD発現により、また３株の全てでCA発現により、NFKB1発現量が有意に減少した。一方でRelB遺伝子では１株でだけ、DGKG-KDやDGKG-CA発現により有意にその発現量が減少した。
そこでリポーターアッセイ法を用いて、実際にNFκBシグナリングにDGKGの発現が影響を与えるかどうかを検討した。リポーターベクターを導入したメラノーマ細胞に腫瘍壊死因子TNFα刺激を１時間加えてNFκBシグナリングを活性化させたところ、このNFκBシグナリング活性化はDGKG-CAの発現によって有意に抑制された。また野生型DGKGやDGKG-KDの発現によってもNFκBシグナリングは抑制される傾向が観察された。以上の結果を合わせると、メラノーマではDGKGの発現によってNFκBシグナリングが抑制されることが示唆された。
現在はウェスタンブロット法で上記の結果を検証しているところである。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
本研究の申請書に記した研究予定では、もう少し幅広く他のDGKアイソザイムや他のがんについても検討を加えるはずであった。メラノーマのテーマにおいて進捗があったので、現在はそちらに集中して研究を進めているが、そちらにしてもメラノーマにおけるDGKGの機能を理解するという目的地はまだ遠く、総合的に当初の予定通りの進行ではないと判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
前年度から引き続き、DGKGの細胞内機能を明らかにする試みを続ける。メラノーマ細胞ではDGKGの発現量が減少していることが多いが、メラノーマ細胞株にDGKGを過剰発現してやるとNFκBシグナリングが抑制されるという初年度の結果がどのように関連するのか、まだわかっていない。幾つかのNFκB関連遺伝子について、その発現量やリン酸化などに着目することによって、DGKGがNFκBシグナリングにどのように関与しているかを解明したい。
また現在後回しにしている他のDGKアイソザイムとがんの関係の解明についての研究を進めたい。具体的には(1)各臓器のがん細胞株におけるDGKアイソフォームの発現を定量RT-PCRにより解析し、(2)臨床検体におけるDGKアイソフォームの発現を定量RT-PCRおよび免疫組織化学染色により解析し、(3)The Cancer Genome Atlas (TCGA)やCOSMIC (Catalogue of Somatic Mutations in Cancer)などの公開データベースを利用して、各がん種におけるDGKアイソフォームのmRNA発現レベル、エピゲノム異常、遺伝子変異を検証する、などの調査を実施して、DGKとがんの関連の実態をつかみたい。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
細胞培養に用いるFCSを新規に購入する必要がなくなったので、次年度へと予算を繰り越すことを判断した。
新年度はFCSを購入することになるが、あいにくのこの時世なので、輸入品が入手できないことや価格の高騰が予想される。予算の使用計画は基本的には本研究申請時に申請書に記した通りであるが、旧年度からの繰り越し金を合わせることにより確実に入手できるようにしたい。
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