| 研究課題/領域番号 |
19K05827
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
古賀 雄一 大阪大学, 工学研究科, 准教授 (30379119)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | Binfing scaffold / 人工抗体 / 熱安定性 / ファージディスプレイ / 可溶性発現 |
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| 研究実績の概要 |
高い構造安定性が期待できる超好熱菌由来のタンパク質を用いることで、高い構造安定性を有したBinding scaffoldを開発できると考え、超好熱菌Fervidobacterium islandicum由来サチライシン様セリンプロテアーゼIslandisinのβ-sandwich domain 1 (SD1) に着目した。
これまでに、変異SD1を提示するファージライブラリーを構築し、TNFαへの結合活性を指標にスクリーニングを行ったが、特異的にターゲット結合する変異SD１は得られなかった。宿主菌体中でのSD1のfoldingの不完全さによる疎水面の露出が非特異的な結合を誘発していることが問題であったことから、大腸菌菌体中でのSD1のfolding能力の向上を目指した。
今年度は、Error-Prone PCR法を用いてSD1全長に対してランダム変異を導入したライブラリーを構築し、目的タンパク質の可溶性発現量が多いほど菌体からのGFPに由来する蛍光強度が増加するシステムである、Split-GFPプレートアッセイによりスクリーニングを行った。その結果、異なるSD1変異体をコードする遺伝子を持つ陽性クローンを6個取得した。これらの陽性クローンを用いて発現誘導を行い、可溶性発現量をSDS-PAGEによって比較したが、得られた変異体の構造形成能は十分に向上していないことが示唆された。そこで、より多くのクローンをスクリーニングするためにFlow cytometryによるハイスループットスクリーニングを実施し、野生型を発現する菌体よりも蛍光強度が高いクローンを取得した。その結果、約148,000個のクローンから約100個の陽性クローンを取得した。野生型SD1の可溶性発現割合が4.4%だったのに対し、44.8%まで改善した変異SD1が得られた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
SD1のBinding scaffoldとしての特性に問題があったことから進捗が遅れていたが、可溶性発現の効率が10倍向上した変異体の構築に成功したことで一定の目処がついた。変異SD1の物性評価を行う必要があるため、当初の目的である特異的binding scaffoldの取得に向けたライブラリー構築までもう少し時間がかかる。
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| 今後の研究の推進方策 |
可溶性が向上した変異SD1を複数取得した上で、可溶性、耐熱性、ファージ提示能を検証しbinding scaffoldとして最適な変異SD1を選抜する。得られた変異SD1に対して、ファージ提示変異ライブラリーを構築し、ターゲットタンパク質に結合した分子の選抜、特性解析を行い、特異的結合SD1のスクリーニングを行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
緊急事態宣言発出に伴い、大学での研究活動期間が短くなったことから経費の使用が抑制された。予定していた学会発表等が中止となり、また、出張を伴う打合せがすべてオンライン会議になったため旅費の使用がなかった。予定されていたファージを使った実験を今年度に伸ばしたため、使用見込みの経費を次年度に繰り越した。
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