| 研究課題/領域番号 |
19K05832
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| 研究機関 | 明治大学 |
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研究代表者 |
渡邉 寛人 明治大学, 農学部, 専任教授 (20270895)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | メイラード反応 / RAGE / コラーゲン / ピリジノリン / 破骨細胞 |
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| 研究実績の概要 |
糖尿病患者においては体内でメイラード反応が亢進し、形成された糖化タンパク質（AGE）その細胞膜受容体であるRAGEを介して糖尿病合併症発症に関わっている。近年われわれはRAGEが認識するAGEの構造特性を解析し、RAGEが3-ヒドロキシピリジニウム（3HP）構造を有するAGEを結合し、細胞に作用することを見出している。加えて、3HP構造を含むコラーゲン架橋分子ピリジノリンがRAGEの内在性リガンドとして機能することを明らかにしている。これら背景から本研究は、3HP構造をもつ新奇AGEの構造と特性を解明することによってRAGEの病理学的意義をさらに明確にすること、および新たなRAGEリガンドであるピリジノリンの作用を明らかにすることによって、RAGEの生理学的意義を解明することを目的として実施している。
本年度はピリジノリンの新たな生理作用の解析を重点的に遂行した。とくにピリジノリンがコラーゲンの分解にともなって遊離することをふまえ、コラーゲン分解をともなう骨吸収機構におけるピリジノリンの作用を解析した。具体的には、マウスRAW264細胞がRANKLによる破骨細胞へと分化する過程におけるピリジノリンの作用を検討した。その結果、ピリジノリンの共存によって巨大な破骨細胞の数が有意に減少した。このことから、ピリジノリンが破骨細胞分化に重要な細胞融合過程を抑制することが示唆された。さらに破骨細胞の骨吸収機能をPit assayにより解析したところ、ピリジノリン共存下で培養した場合、骨吸収窩面積が顕著に減少した。これらの結果から前駆細胞から破骨細胞への分化過程においてピリジノリンが作用し、その分化を抑制するとともに骨吸収機能を抑制することが明らかとなった。これは骨吸収にともなって遊離する骨基質由来分子による新たな骨恒常性制御機構の存在を示唆するものであると考えられる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
糖尿病合併症発症に重要なAGE受容体RAGEの内在性リガンドとして見出したピリジノリンの生理作用は不明であったが、本研究によって骨吸収を抑制しうることが明らかとなった。骨恒常性制御機構の研究はこれまでビタミン、ホルモン・サイトカイン類、リンやカルシウムなどの無機成分にその重点が置かれていたが、本研究成果は代謝過程で放出される骨基質由来成分による新たな制御機構の存在を示唆した点で重要な意義をもつと考えられる。またこの成果は骨恒常性制御という受容体RAGEの新たな役割を示唆したものであり、RAGEの生理学的意義を解明する上で大きな進展があったと考えられる。一方、RAGEの病理学的意義の解明に関しては、前年度に引き続いてRAGEに結合して細胞に作用を示しうる新たなAGE構造を見出しつつあるが、発表可能な成果を挙げる段階には至っていない。
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| 今後の研究の推進方策 |
RAGEの病理学的意義に関しては、すでに予備実験によって3HP構造をもつ新たなAGE構造がある種のペントースから形成されることを見出しており、その解析を進める計画である。具体的にはアセチルリジンとペントースの反応系より、3HP構造に特有のUV吸収を指標としてHPLC分析により新奇構造を検出し、これを精製する。精製したAGEについては質量分析とNMR解析によって化学構造の同定を行う。次いでこの新奇AGEがRAGE組換えタンパク質との結合性を有するか、表面プラズモン共鳴法により解析する。さらにこのAGEが細胞毒性を有するかについてラット神経様細胞PC12を用いて解析する。同時に、ペントースによってタンパク質中にも同様の構造が形成されるか解析を行い、その病理学的意義の解明を進める。
RAGEの新たな生理学的意義については、引き続きピリジノリンの作用解析をとおしてその解明を図る。とくにピリジノリンの破骨細胞分化抑制作用および骨吸収抑制作用の詳細なメカニズムの解析を行う。具体的には、RAW264細胞の分化初期および分化後期におけるいて遺伝子発現がピリジノリンによってどのように変化するか、とくに細胞融合や骨吸収作用に関わる遺伝子を対象に解析する。次いで、すでに明らかにした破骨細胞分化・骨吸収抑制作用や、および遺伝子発現変化に対するピリジノリンの作用において、RAGEが果たす役割を明確なものとするため、RAGE中和抗体共存の効果を検証する。一方、骨形成を担う骨芽細胞への作用に関しては、マウスMC-3T3E1細胞を用いた解析を行う。具体的には細胞分化過程におけるピリジノリンの作用を、分化マーカーであるアルカリホスファターゼ活性染色や遺伝子発現解析により検討する。さらに骨基質形成機能に対する作用を、アリザリンレッド染色法により検討する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
2020年度においてはほぼ計画通りに研究を遂行したため、生じた次年度使用額はわずかであった。2021年度においては、これを含めて有効に使用する計画である。
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