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本研究課題では、糸状菌が生産する無水マレイン酸型モノマーが多量化した化合物群に焦点をあて、一連の化合物の構造多様化機構の解明を目的として研究を行った。具体的には、①骨格構造の異なる酸無水物多量体ゾフィエリン (ZFL) /ホモイドライド (PMD) /コーディアンハイドライド(CAD) 生合成遺伝子の系統的機能解析と②多量化の反応点・反応様式の制御機構の解明に取り組んだ。今年度は、PMDの生合成について解析した。
前年度に構築した無水マレイン酸型モノマーの二量体を生産する麹菌形質転換体を宿主として、PMD生合成経路の再構築を試みた。初めに、二量体生産株に酸化酵素遺伝子をはじめとする生合成に関与すると推測された遺伝子を導入し、二量体の変換を試みた。二量体生産株を対照として得られた各形質転換体の代謝物をLC-MSにより分析した結果、二量体の酸化を示唆する新たな生成物を得ることができた。質量スペクトル等の情報から、本化合物が天然物として知られるPMD-Aであることが示唆された。また、この酸化体からさらに変換が進んだ化合物を生産する形質転換体も得られた。同様に質量スペクトル等の情報を解析した結果、本化合物がPMD-Bであることが示唆された。これによりPMD-Bが、二量体の酸化によるPMD-Aの生成を経て生合成されることが示唆された。
続いて、異種発現実験から示唆された生合成経路をより詳細に検証した。このために、大腸菌を宿主として各生合成酵素を組換えタンパク質として調製した。得られた組換え酵素を用いて二量体を基質とする酵素反応を行い、LC-MSを用いて反応生成物を解析した結果、麹菌宿主での異種発現から推定された生合成経路を支持する結果を得た。
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