| 研究課題/領域番号 |
19K05946
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| 研究機関 | 東京農工大学 |
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研究代表者 |
森山 裕充 東京農工大学, (連合)農学研究科(研究院), 教授 (20392673)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | マイコウイルス / 2本鎖RNAウイルス / ウイルス蛋白異種発現 / パン酵母 / 微生物培養 |
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| 研究実績の概要 |
本研究ではパン酵母の遺伝子工学手法、高い培養計測と制御系を利用することで、植物病原糸状菌に感染するマイコウイルスのRNAゲノム遺伝子の機能解析を行う。その評価系としては酵母細胞異種発現系によって顕在化される細胞の増殖や各種ストレス感受性などに及ぼす影響を指標として行ってきた。初年度はナシ黒斑病菌Alternaria alternata Japanese pear pathotype N18株に感染するマイコウイルスAaCV1, Alternaria alternata chrysovirus 1の全長ORF2タンパク質（771 aa）と、ORF2タンパク質のうちβ-Chrysoviridae属のウイルス間で保存性が高い領域であるSUaタンパク質(251 aa)の酵母細胞の生育について、詳細な調査を行った。
その結果、同属ウイルスのMoCV1-A ORF4タンパク質と、その保存性配列由来のSUaタンパク質や全長AaCV1 ORF2タンパク質と同様に、AaCV1 ORF2 SUaタンパク質も酵母細胞に生育阻害を引き起こすことが明らかとなり、昨年度までに観察されてきた生育促進現象は再現されない結果が得られた。これらMoCV1-A ORF4/SUa, AaCV1 ORF2/SUaとGFPとの融合タンパク質は、酵母細胞内で強い凝集性を示し、細胞内でのタンパク質の凝集により細胞毒性を発揮するという示唆を得た。
今後、MoCV1-A ORF4とAaCV1 ORF2を酵母細胞内で発現させた時に現れる凝集性と、それによってもたらされる生育阻害現象について注力していき、昨年度まで注力してきたAaCV1 SUaタンパク質発現による生育促進現象の追求は本プロジェクトにおいては一時中断することとした。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究では、酵母細胞に生育促進を齎すと考えられてきたAaCV1 ORF2 SUaタンパク質の異種発現が細胞に与える影響を再評価し、同属ウイルスのMoCV1-A ORF4タンパク質やその保存性配列由来のSUaタンパク質、また全長のAaCV1 ORF2タンパク質と同様にAaCV1 ORF2 SUaタンパク質が酵母細胞に生育阻害を引き起こすことを明らかにした。さらに、MoCV1-A ORF4/SUa, AaCV1 ORF2/SUaと GFP との融合タンパク質の発現により、これらのタンパク質が凝集性を有し、細胞内でのタンパク質の凝集により細胞毒性を発揮するという示唆を得た。昨年度までにW303-１A株にAaCV1 ORF2/SUaを発現させた時に生じる生育促進現象は再現性に問題があることが判明した。改めてpRST426-SUa配列をW303-1A株に導入する実験では生育阻害を示すことで明白となった。実はコントロール株としたW3-3-1A株が分裂寿命の短い変異株であることが判明した。この変異はミトコンドリアを欠失させたρ細胞でも生じ、ミトコンドリアをサイトダクションで交換しても継続することから、核染色体が支配する解糖系代謝制御に変異が生じたことが予想された。また、これまでSUa導入生育促進として扱っていた株は、URA３遺伝子の点突然変異により復帰していた。BY4742株におけるSUa導入株も染色体中にURA3が挿入されていた（四分子解析で１遺伝子挿入を確認済）。
尚、分裂寿命が短く（６～7回）生育速度が遅延するW303-1A株は、L-Aウイルスフリー化株を選抜する際に単離しており、このW303-１A株にサイトダクションでL-Aウイルスを感染させると、低いコピー数で維持することから、L-Aウイルスに関与するアリル変異（SKI、MAK遺伝子群など）が、生育不良と関係することが示唆された。
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| 今後の研究の推進方策 |
これまでに生育促進を齎すと仮定したAaCV1 ORF2 SUaタンパク質の解析は一時中断して、凝集性による毒性の為に生育阻害を齎す現象について、本プロジェクトではシフトする。尚、マイコウイルス感染による糸状菌の生育促進現象は、Imperial College London の研究グループでAspergillus fumigatus (Fungal Genetics and Biology 76 (2015) 20-26, Frontiers in Microbiology 12 (2021) 60366), Colletotrichum higginsianum (Archives of Microbiology 203 (2021) 241-249)で報告があり、硝酸取り込み量の向上が要因である。AaCV1 ORF2を宿主菌であるAlternaria alternata に遺伝子導入した結果、菌叢生育や病原力が向上したことから、AaCV1 ORF2 SUaは酵母細胞にも生育促進を付与する可能性が推測されたが、現時点では追試実験で再現性が取れないことから上述の如く中断する。
まず、RNA-seqによる各遺伝子の転写量の増減調査を行い、MoCV1-A ORF4、AaCV1 ORF2を発現させた際に、生育阻害現象に関連する宿主側遺伝子の同定を試みる。初回検討として、バッフルフラスコ(200ml容)を用い、BY4742菌株のコントロール菌株と各ウイルス由来ORFタンパク質導入酵母をそれぞれ12～20時間培養し、対数増殖期にある状態のサンプルを用いる。更に細胞壁合成阻害をカルコフルホワイト染色、DAPI染色による核やミトコンドリアの動態変化への影響についても調査していく。
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