| 研究課題/領域番号 |
19K05952
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| 研究機関 | 琉球大学 |
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研究代表者 |
水谷 治 琉球大学, 農学部, 准教授 (10443996)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 麹菌 / ゲノム編集 / 人工ヌクレアーゼ (TALEN) / CRISPR/Cas9 / DNA 二本鎖切断修復 / ligD |
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| 研究実績の概要 |
黄麹菌において TALENs や CRISPR/Cas9 といったゲノム編集ツールを用いて非相同末端結合 (Nonhomologous end-joining: NHEJ) の修復エラーを利用したゲノム編集を行うと、得られた株の半分程度で 1 kb 以上の大規模な欠失が引き起こされることを見出し、このメカニズムの解明に取り組んでいる。現在までに NHEJ 経路の最終反応に寄与する ligase (ligD) が大規模欠失に関与することが示唆されている。また、黄麹菌大規模欠失抑制株を取得しており、そのゲノム配列解析を次世代シークエンサーにて行っている。本年度は、前年度ロストしてしまった ligD 遺伝子過剰発現株及び、ligD 遺伝子のネイティブプロモーターを用いた ligD 遺伝子発現株を造成した。また、ligD 遺伝子以外の NHEJ 修復経路の構成因子が、ゲノム編集時に引き起こされる大規模欠失に関与するか調べるために、DNA 2 本鎖切断時に末端保護の役割を有する ku70 及び、切断末端の加工に関与すると言われているヒト polymerase u のホモログである polD の破壊株を造成した。今後はこれらの株についてもゲノム編集を行い、大規模欠失が引き起こされるかを検討していく。一方、黄麹菌大規模欠失抑制株のゲノム解析では、新規 (de novo) アセンブリを行い、 ligD 遺伝子の塩基配列を確認した所、ゲノム解析株（野生株）と同じであることを確認した。また、黒麹菌においても黄麹菌と同様にゲノム編集を行うと大規模欠失が観察されるかを調べるための準備を行った。具体的には、市販細胞壁溶解酵素のみでプロトプラスト・PEG 法によるゲノム編集が行えるようにするため、黒麹菌宿主（agsE, ligD 二重破壊株）に ligD 遺伝子を再度、戻す必要があり、その作業に必要な新規薬剤耐性マーカー遺伝子の開発を行った。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
新型コロナウイルス感染予防による大学の入校禁止による研究遅延及び、その期間中による保存黄麹菌株のいくつかでコンタミによるロストが生じ、再度、造成し直す等、遅れが生じてしまった。また、大規模欠失変異株のゲノム解析に必要な wet 解析の知識習得が予定以上に時間がかかってしまったため、やや遅れているとした。
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| 今後の研究の推進方策 |
黄麹菌において、本年度に造成した ligD 遺伝子過剰発現株及び、ネイティブプロモーターによる ligD 発現株を用いて、TALENs または、CRISPR/Cas9 を用いた DNA 2 本鎖切断を引き起こし、ligD 遺伝子が大規模欠失に関与しているかを観察する。加えて、NHEJ 修復構成因子の ku70 及び polD の破壊株に対しても同様に大規模欠失が引き起こされるか観察を行う。また、引続き大規模欠失抑制変異株のゲノム解析を進め、変異箇所の同定を行う。変異箇所の遺伝子情報から大規模欠失に関与が考えられそうな遺伝子から、順次、野生株に対して、当該遺伝子の破壊または、同様な変異を付与していく。加えて、黒麹菌でも NHEJ 修復エラーを介したゲノム編集を行い、黄麹菌と同様に大規模欠失が引き起こされるかを観察する。黄麹菌と同様に大規模欠失が観察された場合は、黄麹菌のデータを参考にどの遺伝子が大規模欠失に関与するかを調べていく。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本学の改修工事が新型コロナウイルスの影響で遅延し、新しい研究室への移動が本年度中に出来なかったため、ゲノム編集株群などの菌株保存用に購入を予定した超低温フリーザーを見送ったこと、更に、計画していた国際学会や国内学会の中止により旅費の執行が出来なかったため、その金額が次年度分の繰越となってしまった。次年度は最終年度であるため、菌株保存用超低温フリーザーの購入を一旦諦め、クリーンベンチを１台追加し、研究をより早く進められるようにしたいと考えている。また、本年度と同様に次年度も参加予定の学会が中止やリモート開催により、旅費の執行が難しい場合は、ゲノム編集株群のシークエンス解析費等に使用出来るように変更する予定である。
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