| 研究課題/領域番号 |
19K05952
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| 研究機関 | 琉球大学 |
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研究代表者 |
水谷 治 琉球大学, 農学部, 准教授 (10443996)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 麹菌 / ゲノム編集 / 人工ヌクレアーゼ (TALENs) / CRISPR/Cas9 / DNA 二本鎖切断修復 / 非相同末端結合 |
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| 研究実績の概要 |
黄麹菌においてゲノム編集ツールを用いて非相同末端結合 (Nonhomologous end-joining : NHEJ) の修復エラーを利用したゲノム編集を行うと、得られた欠失株の半分程度で 1 kb 以上の大規模な欠失が引き起こされることを見出し、このメカニズムの解明に取り組んでいる。現在までに NHEJ 経路の最終反応に寄与する ligase (ligD) が大規模欠失に関与することが示唆されている。今年度は、前年度に造成された DNA 2 本鎖切断時に末端保護の役割を有する ku70 及び、切断末端の加工に関与すると言われているヒト polymerase や酵母 POL4 のホモログである polD の破壊株に対して、TALENs 及び CRISPR/Cas9 を用いて NHEJ 修復エラーを介したゲノム編集を行った。その結果、polD 破壊株を宿主としてゲノム編集を行ったところ、数多くのゲノム編集株が得られた。ターゲット領域の解析を行ったところ、どちらのゲノム編集ツールを用いた場合でも野生株とほぼ同程度の割合で大規模欠失が観察された。NHEJ 修復経路に関与するポリメラーゼは、ヌクレアーゼ活性も有していることが知られており、DNA 2 本鎖切断修復による大規模欠失に直接的に関与するのではないかと思われたが、大規模欠失に影響を及ぼさないことが示唆された。一方、ku70 破壊株を宿主として同様にゲノム編集を数回試みたが、ゲノム編集された株が 1 株しか得られなかった。そのため、引き続き検討が必要であるが、ku70 遺伝子を破壊するとゲノム編集自体が起こりにくい可能性が示唆された。また、黄麹菌大規模欠失抑制株のゲノム解析を引き続き行ったところ、1124 箇所の変異があることが明らかとなった。今後は有意な変異と思われる遺伝子の探索を行っていく予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
黄麹菌における大規模欠失機構の解明についてはある程度進めることが出来たが、黒麹菌に関して、ゲノム編集による DNA ２ 本鎖切断が黄麹菌と同様に大規模欠失を引き起こすかの実験がほとんど出来なかった。そのため、延長願いを申請し次年度以降も科研費研究を続けさせて頂くことにした。
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| 今後の研究の推進方策 |
黄麹菌において、ku70 遺伝子破壊株を宿主としてゲノム編集を行うと、本当にゲノム編集体がほとんど取れなくなるのか再度、検討する。また、polD 以外の NHEJ 修復構成因子において、ヌクレアーゼ活性を有すると考えられている遺伝子ホモログの破壊株を造成し、同様に大規模欠失が引き起こされるか調べていく。また、上記の破壊株が大規模欠失に関与する場合、機能相補株の造成を行い、当該遺伝子が確実に大規模欠失に関与しているかを調べる。また、大規模欠失抑制変異株のゲノム解析を引き続き行う。特に、DNA 修復機構に関与する遺伝子に変異がないかを調べる。必要があれば、ナノポアシーケンサーを用いた長鎖シーケンスの導入を行い、ショートリードで得られたデータと合わせることで精度の高い配列情報を取得する。黒麹菌に関しても NHEJ 修復エラーを介したゲノム編集を行い、黄麹菌と同様に大規模欠失が引き起こされるかを観察する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
研究の進展が少し遅く、予算執行が滞ったことに加え、研究推進用に購入させていただいたクリーンベンチがキャンペーン価格で購入できたことに起因する。研究期間を延長させて頂いたため、残りの予算は本研究に必要な消耗品費として使用する。
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