| 研究課題/領域番号 |
19K05957
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| 研究機関 | 明星大学 |
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研究代表者 |
清水 光弘 明星大学, 理工学部, 教授 (80231364)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | HMGタンパク質 / ヒストン / ヌクレオソーム / クロマチン動態制御 / ゲノム機能発現 / 出芽酵母 / 部位特異的化学切断法 / タンパク質-DNA相互作用 |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、ヌクレオソームを構成するヒストンH2A、H2B、H3、H4に加えて、非ヒストン性タンパク質HMGB（High-Mobility-Group Box）に焦点を当て、出芽酵母ゲノムにおけるクロマチンの動態制御機構を明らかにすることを目的とする。HMGBは酵母からヒトまで広く保存され、クロマチンの構築とリモデリング、エピジェネティクスなどに重要な機能を有することが報告されている。本研究の特色は、遺伝学・分子生物学的手法と化学的アプローチを組み合わせた部位特異的化学切断法によって、出芽酵母ゲノムにおけるクロマチン構築タンパク質のDNA結合部位を明らかにできることである。
この目的のために、我々は、ヒストンH2A、H2B、H3、H4、HMGBホモログのHmo1、Nhp6A、Nhp6B、ヒストンH1ホモログHho1のCys変異株を約40種類構築した。これらの株を用いて、以下の成果を得た。
1．ヒストンおよびヒストンバリアントのDNA結合部位の解析：アガロースゲル電気泳動・間接末端標識法と次世代シーケンサーにより、出芽酵母ゲノムにおけるヒストンH2A、H2B，H3，H4とヒストンバリアントH2A.Z，Cse4のDNA結合部位の検出に成功した。これらの結果を基にして、個々の遺伝子座におけるヌクレオソーム動態の解析を進めている，また，次世代シーケンサーを用いて，出芽酵母ゲノムにおけるヌクレオソームポジションの新規解析法の確立を目指している。
2．HMGBホモログのDNA結合部位の解析：リボソームタンパク質遺伝子RPS6座とRPS11B座のプロモーター領域におけるHmo1の結合部位の同定に成功した。この結果から，Hmo1はヌクレオソームフリー領域（NFR）の形成に関与することが強く示唆され，現在、転写活性との関係、リンカーヒストンHho1との競合との関係について調べている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
研究実績の概要で述べたように、研究対象とするタンパク質についてデザインしたCys変異が概ね機能して、それらの株を用いた部位特異的切断法の実験系を確立した。そして、各コアヒストン、ヒストンバリアント、HMGBホモログHmo1のDNA結合部位を、アガロースゲル電気泳動・間接末端標識法と次世代シーケンサーによって検出することに成功した。現在、次世代シーケンサーの結果の解析を進めており、出芽酵母ゲノムにおけるヌクレオソームポジションの新規解析法になることが期待される。また、標的遺伝子のプロモーター領域でのHmo1の結合部位の解析から、Hmo1とヌクレオソーム配置との関係という新規の視点から考察できることが期待できる。
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| 今後の研究の推進方策 |
これまでに構築した、Hmo1、Nhp6A、Nhp6BならびにヒストンのCys変異株を約40種類有している。これらの株に対して、研究代表者らが確立した部位特異的化学切断法とMNase法を並行適用する。得られたDNA断片を次世代シーケンサーで解析（Chem-seq、MNase-seq）することによって、出芽酵母ゲノムの単一遺伝子座におけるヌクレオソームの配置と各タンパク質のDNA結合部位の全体像を明らかにする。
また、Hmo1によるヌクレオソームフリー領域の形成の分子機構を解明するために、RPS遺伝子群の転写とヌクレオソーム動態を解明する必要がある。それに向けて、次世代シーケンサーを用いたヒストンH2AとH4のChem-seq解析が現在進行中である。
さらに、ヒストンバリアントの機能解析，転写およびヒストンの翻訳後修飾との関連、ヒストンの翻訳後修飾との関連、細胞周期における動態、二重鎖切断と相同組換えにおける役割について研究を展開する。
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