| 研究課題/領域番号 |
19K05961
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| 研究機関 | 岡山県農林水産総合センター生物科学研究所 |
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研究代表者 |
鳴坂 真理 岡山県農林水産総合センター生物科学研究所, その他部局等, 流動研究員 (80376847)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 抵抗性蛋白質 / エフェクター / アブラナ科炭疽病菌 / シロイヌナズナ / 植物免疫 |
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| 研究実績の概要 |
植物病原糸状菌の炭疽病菌は、1000種以上のエフェクターを宿主植物の細胞内に分泌して、宿主の抵抗反応を妨害し、その感染を成立させている。これに対して、植物は抵抗性(R)蛋白質を介して病原菌が分泌するAVRエフェクターを認識し抵抗反応を発動する。これまでに本AVRエフェクターの特定に向けて、アブラナ科炭疽病菌のゲノム情報より約300種のエフェクターを推定し、モデル実験植物Nicotiana benthamianaを用いた一過的な遺伝子発現系におけるスクリーニングを行った。また、新たに約150遺伝子のエフェクター候補について、昨年度に構築した過敏感反応（細胞死）の誘導を指標とした実験系により、AVRエフェクターの探索を行ったが、過敏感反応を示すエフェクターは得られなかった。一方で、R蛋白質を介さず、単独で過敏感反応を誘導するエフェクターは数種類得られている。 また、アブラナ科炭疽病菌を含む複数の病原菌を認識するデュアルR蛋白質システムでは、RPS4とRRS1が協調して病原菌に対する抵抗性を誘導する。この作業仮説ではRRS1がRPS4の制御因子として機能することが推定される。そこで、RRS1のC末端領域に着目し、6アミノ酸ずつをアラニンに置換して、アブラナ科炭疽病菌およびトマト斑葉細菌病菌に対する反応を調査した。その結果、C末端領域の24アミノ酸配列のうち、アミノ酸置換によって両病原菌に対して感受性となる領域と過剰に抵抗性が誘導される領域が存在することが明らかとなった。後者の領域がデュアルR蛋白質システムにおけるRPS4の制御に関与している可能性が考えられる。また、アブラナ科炭疽病菌に対する認識においては、さらに上流に3ヶ所の感受性領域が認められ、RRS1が複数の病原菌を認識するために重要な役割を担っていることが示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
今までにクローニングした90遺伝子のエフェクター候補遺伝子に加え、新たに選定した約150遺伝子のエフェクター候補について、過剰発現型コンストラクトへ置換し、アグロバクテリウムへ導入した。R蛋白質またはエフェクターが導入されたアグロバクテリウムを共インフィルトレートし、タバコ(Nicotiana tabacum)成葉を用いて、過敏感反応（細胞死）の誘導を指標としたAVRエフェクターの探索を行った。しかし、デュアルR蛋白質システムとの共インフィルトレートのみで特異的に細胞死が誘導されるエフェクターは得られなかった。一方で、初期のエフェクター候補として選定した90遺伝子のエフェクターには、R蛋白質を介さず、単独で過敏感反応を誘導するものが複数個認められた。
これまでの結果より、デュアルR蛋白質システムを構成するRRS1蛋白質のC末端領域が病原菌の認識に関わっていると推察している。そこで、C末端に変異を導入したRRS1を、RRS1蛋白質が欠損したrrs1-1変異体へ導入し、T3ホモラインについてアブラナ科炭疽病菌およびトマト斑葉細菌病菌に対する感受度検定を行った。アミノ酸置換部位が病原菌の認識に関与しない場合は、機能相補により病原菌に対して耐性を示す。病原菌接種試験の結果、RRS1のC末端領域の24アミノ酸配列のうち、18アミノ酸が病原菌の認識に関与することが明らかとなった。一方で、過剰な抵抗性を誘導する6アミノ酸の変異を導入したシロイヌナズナでは、植物体の生育抑制が認められた。この結果は、本アミノ酸領域がRPS4の制御に関わることを示唆している。また、アブラナ科炭疽病菌に対する認識においては、さらに上流に3ヶ所の感受性領域が認められ、RRS1が複数の病原菌を認識するために重要な役割を担っていることが示唆された。
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| 今後の研究の推進方策 |
当初の予想通り、AVRエフェクターの同定は非常に困難である。現在までに、アブラナ科炭疽病菌が有する1000種以上のエフェクター候補のうち、約500遺伝子について探索したが、デュアルR蛋白質システムが認識するAVRエフェクターの同定には至っていない。一方で、R蛋白質を介さず、単独で過敏感反応を誘導するエフェクターは数種類得られており、宿主植物に対して、感染時に機能する可能性が示唆された。これらのエフェクターについて、インフィルトレート条件を検討し、デュアルR蛋白質システムのAVRエフェクターとして機能するか再検討を行う。
RRS1のC末端領域については、Ralstonia solanacearumの認識に関わっていることが示唆された（Guo et al. 2020）。本課題においても、RRS1のC末端領域が炭疽病菌および斑葉細菌病菌の認識に関わっていることが明らかとなった。特に、RRS1のC末端領域の24アミノ酸配列のうち、RPS4の制御に関与する可能性が認められた6アミノ酸に着目する。6アミノ酸をアラニンに置換した変異型RRS1はアグロバクテリウムを介した実験系において、RPS4との共インフィルトレートにより過敏感反応を誘導する。本検定系を用いて、RPS4の制御に関わるアミノ酸の特定を試み、RRS1のC末端領域が多様な病原体の認識機構に関わっていることを明らかにする。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
デュアルR蛋白質システムを構築するRPS4/RRS1複合体において、RRS1がRPS4を制御することが推定された。そこで、RRS1がRPS4を制御するために重要なアミノ酸部位を特定するために、RRS1へ変異を導入する必要が生じた。本解析におけるコンストラクトの作製、形質転換植物の育成およびバイオアッセイに時間を要するため。
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