| 研究課題/領域番号 |
19K06034
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| 研究機関 | 岡山大学 |
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研究代表者 |
原田 太郎 岡山大学, 教育学研究科, 講師 (80468256)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | エチレン依存性花弁老化 / エチレン応答因子 / MA包装 |
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| 研究実績の概要 |
カーネーションのエチレン依存性花弁老化および低酸素による咲き進みまたは老化の抑制（品質保持）へのエチレン応答因子（ERF）の関与を明らかにするため，カーネーションのERF遺伝子ファミリーの解析を進めた．
第一に，32個のERF遺伝子のcDNA部分配列のクローニングおよび発現解析を行った．これまでにクローニングを終了していた8遺伝子に加え，新たに20遺伝子のクローニングを終了した．また，過去に得られたデータの再現性確認のため，新たに老化過程およびエチレン処理後の花弁サンプルを用意し，それらを用いてリアルタイムPCRによる発現解析を進めた．
第二に，エチレン曝露下で発現上昇を示すDcERF4のタンパク質発現解析の準備として，抗体作製およびウェスタンブロットの予備実験を行った．抗体作製サービスを利用し，DcERF4を特異的に認識できる可能性の高い抗ウサギ抗体を得た．それを用いてウェスタンブロット解析を試みたところ，予測されるサイズ（約32 kDa）付近にバンドが得られ，そのシグナルが満開花弁サンプルに比べ，老化花弁サンプルにおいて強いという結果が得られた．
第三に，DcERF4のプロモーター機能解析の準備として，DcERF4のプロモーター領域およびDcEIL3のクローニングを進めた．いずれも目的のサイズの断片が得られたため，現在クローニングを進めている．
第四に，切り花の品質保持に有効なMA包装条件の検討と，低酸素応答性ERF遺伝子DcERF19の発現解析を行った．脱酸素剤を用いた低酸素包装では切り花の品質保持効果が得られないことが判明したため，MA包装すなわち切り花の呼吸のみによりバッグ内の酸素濃度を下げる包装を試したところ，封入本数の調節により品質保持効果が得られることがわかった．また，MA包装下の花弁でDcERF19の発現が上昇することを確認した．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ERF遺伝子のクローニングについては概ね終了しているが，ファミリーの1つ（DcERF5）についてはさまざまなPCR条件で増幅を試みたものの，目的とする増幅断片が得られなかったことから，用いた品種に同一の配列が存在しないか，発現していないものと判断した．DcERF4のタンパク質発現解析については，まだデータを得るに至っていないが，抗体が有望であることを示唆する結果が得られたことは大きな進展と言える．DcERF4のプロモーター機能解析の準備については，レポータアッセイ用のベクターも既に入手し，コンストラクト設計（制限酵素の選択）も踏まえた遺伝子断片のクローニングを進めることができている．また，ERF遺伝子の低酸素応答調査のための実験系の候補としてMA包装が有望であることを確認できたことも，来年度以降の研究にとって重要な進展である．
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| 今後の研究の推進方策 |
ERF遺伝子のクローニングおよび発現解析については，次年度中にデータをまとめることを目指し，リアルタイムPCRを用いたデータセットの取得を計画的に行う．DcERF4のタンパク質発現解析については，電気泳動条件等をさらなる予備実験により検討したうえで，データの取得を目指す．万一，ウェスタンブロットにより実験データが得られない場合には，緑色蛍光タンパク質（GFP）を用いたレポーターアッセイによりその発現を確認する実験を行うことも想定している．DcERF4のプロモーター機能解析については，使用するコンストラクトの作製を進めるとともに，次年度ルミノメーターを購入し，レポーターアッセイのための予備実験を進める．
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