研究課題/領域番号 |
19K06053
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研究機関 | 岡山大学 |
研究代表者 |
松井 英譲 岡山大学, 環境生命科学研究科, 准教授 (20598833)
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研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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キーワード | リン酸化タンパク質 / MAMP / PTI / MTI |
研究実績の概要 |
植物の備えるPattern-triggered immunity (PTI)は広範な病原菌に対して有効な防御機構である。植物は微生物の構成成分(microbe-associated molecular pattern: MAMP)を、細胞膜上に存在するパターン認識受容体が認識し、リン酸化を介したシグナル伝達により広範な病原菌に対する抵抗性を誘導する。しかしながら、MAMP認識の下流については依然として不明な点が多い。 申請者らはMAMP誘導性リン酸化タンパク質(MAMP-responsive phosphoproteins: MRPs)を同定し、mrp遺伝子のT-DNA挿入変異体の解析を通じて、flg22処理時にカロース蓄積が低下する変異体を同定した(MARK2と命名)。MARK2はMPK3/6の基質であり、変異体を用いた解析から、MARK2は植物病原細菌に対する抵抗性に重要な役割を果たすことが示唆された。一方で、MARK2は機能未知なタンパク質であり、MARK2がカロース蓄積を含む抵抗性反応をどのように制御するかは全く明らかになっていなかった。 本年度は、MARK2相互作用因子の探索ならびにMARK2の細菌感染時の抵抗性応答を検証した。一過的発現系により、MARK2-GFPタンパク質の精製したところ、200-400kDaにMARK2-GFPタンパク質が検出された。つまり、MARK2は多量体もしくは複合体を形成すると考えられた。一方、Y2Hにより同定したMARK2相互作用因子MK2BP1は、一過的発現に伴い細胞内で共局在を示すものの、in vitroの実験系では相互作用は示さなかった。そこでMARK2-GFP形質転換シロイヌナズナを利用して、MARK2タンパク質の検出ならびに相互作用因子の同定を進めている。
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現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
本年度はカロース蓄積の制御に関わるMARK2タンパク質の相互作用因子の同定を目指した。ニコチアナベンサミアナタバコを用いた一過的発現系を用い、MARK2-GFPタンパク質の相互作用因子の探索を進めた。MARK2-GFPタンパク質は分子量約200-400kDa付近に検出された。MARK2-GFPの分子量は推定80kDaであることから、MARK2は多量体もしくは複合体を形成すると考えられた。Yeast two hybrid screeningでは、MARK2はダイマー形成することが明らかになっており、本結果とも一致する。銀染色の結果、MARK2-GFP精製画分に複数の特異的なバンドが検出され、MARK2は複合体を形成する可能性が考えられた。一方で、ニコチアナベンサミアナの系はヘテロな試験系であり、プロテオーム解析による相互作用因子の同定はやや難しいと考えられ、シロイヌナズナで安定的なMARK2-GFP形質転換体を作出した。常法に従いMARK2-GFPタンパク質の精製、検出を試みたが、現在までにMARK2タンパク質の検出に至っていない。MARK2 own promoterによる発現系のため、タンパク質蓄積量が低い可能性も考えられ、抽出、精製手法の検討が必要である。 mark2変異体はPtoのスプレー接種でより罹病性を示したことから、気孔免疫に関わると考えていた。しかし、mark2変異体においてカロース蓄積は葉全体で低下することから、infiltration接種を試みた。その結果、mark2変異体は野生株と比べより罹病性を示すことが明らかとなった。
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今後の研究の推進方策 |
MARK2タンパク質の機能解明に向けて、MARK2タンパク質の検出の条件検討は欠かすことができない。Y2Hで同定したMARK2相互作用因子MK2BP1は、一過的発現系においてMARK2と共局在を示すものの、物理的な相互作用は検出できなかった。安定的なMARK2-GFP形質転換体が作出できたことから、本形質転換体を利用し、MARK2タンパク質の発現および検出条件を検討する。これまでにMARK2pro-GUS形質転換体の解析結果から、MARK2遺伝子はPtoや、Pto avrRpm1の接種後に全身で強い発現誘導されることを見出している。そこで発現誘導時のMARK2の相互作用因子についても検出できる系を構築する。タンパク質精製の技術的な助言は、シロイヌナズナで植物免疫複合体の精製で実績のある理化学研究所植物免疫グループの門田博士より受けており、新たな実験系で検出を試みる。 MARK2は糸状菌の細胞壁の構成成分であるキチンでもリン酸化が誘導される。MARK2pro-GUS形質転換体へのBotrytis cinereaの接種に伴い、MARK2遺伝子発現が感染部位で誘導されることから、糸状菌に対するMARK2遺伝子の重要性についても検証する。カロース蓄積は糸状菌に対する抵抗性に重要であることからも、MARK2の分子機能に迫れると考えている。
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次年度使用額が生じた理由 |
コロナウイルス感染症に伴い、植物育成に中断が生じた。形質転換植物の作出に遅れが生じたことなどに伴い、年度内に計画した研究に取り掛かることが出来なかったため、次年度の使用額が生じた。次年度では、相互作用因子の同定に高価な遺伝子工学試薬、生化学が必要であることから、研究計画に基づき利用する。
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