| 研究課題/領域番号 |
19K06055
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| 研究機関 | 愛媛大学 |
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研究代表者 |
小林 括平 愛媛大学, 農学研究科, 教授 (40244587)
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| 研究分担者 |
賀屋 秀隆 愛媛大学, 農学研究科, 准教授 (80398825)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 遺伝子組換え植物 / 細胞死 / 植物ウイルス / 植物免疫 / 退緑黄化 / 病徴 |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、ウイルス病における退緑黄化などの症状の発症に関わるメカニズムを明らかにする目的で、ウイルス遺伝子の発現、あるいは葉緑体タンパク質遺伝子の発現抑制によって、人為的に退緑黄化を誘導可能な遺伝子組換えモデル植物を用いて解析している。2019年度までにキュウリモザイクウイルス（CMV）のYサテライトとモモ潜在モザイクウイロイドの病原性標的であるChlIおよびHsp90Cの発現を任意のタイミングで抑制することのできる退緑モデル植物（i-amiChlIタバコおよびi-hpHsp90Cタバコ）を作出した。これらにおける網羅的遺伝子発現解析の結果から、植物の病害に対する防御応答に関わる遺伝子の発現が退緑黄化の発症と関連していること、さらに葉における加齢依存的な散在性の細胞死が症状の劇症化に関与することを示した。また、両退緑モデル植物に共通な経路として活性化の顕著なサリチル酸（SA）が退緑黄化発症における役割を明らかにする目的で、2020年度にはSA分解酵素遺伝子（nahG）を導入したタバコを作出し、各系統におけるnahG遺伝子の発現量を調査し、高発現系統を選抜した。また、SAによるウイルス抵抗性を抑制することが報告されているCMVの2b遺伝子とその部分欠失変異体を導入したタバコを作出した。
2021年度は、前年度の作出したnahGおよびCMV 2b発現植物と退緑モデルタバコの交配系統を育成するとともに、SA経路において重要な役割を果たすことがシロイヌナズナで示されている転写因子群、SARD1およびCBP60gのタバコホモログを探索し、ゲノム編集技術による遺伝子破壊株の作出に着手した。四倍体であるタバコでは、S-およびT-ゲノムにCBP60gホモログは1個ずつ、SARD1ホモログは2個ずつ存在した。これら3個の標的標的遺伝子について、S-およびT-ゲノムに共通した配列を標的とし、ゲノム編集酵素を導入した形質転換タバコを作出した。現在、標的遺伝子破壊系統のスクリーニングを進めている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
SAは退緑黄化の劇症化をもたらす細胞死等に関与することが強く示唆される。nahGを導入した退緑モデル二重遺伝子組換え植物で退緑の抑制を観察していたが、対照として蛍光タンパク質遺伝子を導入したi-amiChlI/EGFPタバコにおいて退緑黄化の誘導が抑制された。そこで、野生型タバコにnahG遺伝子を導入して高発現系統を作出し、発症モデル植物と交配する手法をとることとしため、研究計画に遅延が生じている。すでにnahGを高発現する8系統を退緑モデル植物と交配し、後代植物を育成しており、遅延は最小限に食い止められたと考えている。一方、ゲノム編集によるサリチル経路関連遺伝子の破壊については、2020年4月から担当を予定していた外国人留学生の来日がコロナ禍で1年半延期になって遅延していたが、2021年から学部生が参加したことに加え、留学生が2021年9月に来日し、遅れを取り戻すべく鋭意取り組んでいる。
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| 今後の研究の推進方策 |
nahG導入タバコについては、退緑モデル植物と交配した後代を育成中であり、2022年度中にSAが退緑発症に関与するか否かを明らかにできると考えている。さらにSA等植物ホルモンの定量において実績のある研究者と共同研究を開始したことから、nahGのSA分解効率や、他の植物ホルモン合成等に対する影響も解析可能になる。また、これまでに行ってきた網羅的発現解析を組合わせることによって、退緑黄化発症におけるSA等植物ホルモンの役割を明らかにする。ゲノム編集による植物免疫関連転写因子遺伝子を破壊したタバコの作出についても、現在スクリーニング中の形質転換タバコから遺伝子破壊個体を選抜する。退緑モデル植物との交配系統および多重変異体を作出し、2022年度内にそれら転写因子が植物免疫および退緑黄化の発症に果たす役割のを明らかにすることを目指す。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
コロナ禍で留学生の渡日が遅れたため、計画していた次世代シーケンサー解析の委託を要する実験が遅延したことから、高額の未使用額を生じた。当該実験についてはすでに進めており、2022年度第一四半期中に実施する。
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