| 研究課題/領域番号 |
19K06086
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| 研究機関 | 山梨大学 |
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研究代表者 |
山村 英樹 山梨大学, 大学院総合研究部, 准教授 (70516939)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 超希少放線菌 / 遺伝資源 / 選択分離法 / 土壌 / 分類 |
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| 研究実績の概要 |
放線菌は土壌などの環境試料中に多く存在しており、その多くはストレプトマイセス属が占めている。一方で、残り５％は希少放線菌と呼ばれ、さらに運動性を有する放線菌はさらに分布数は低く、全放線菌の１％にも満たない存在である。我々はこの１％を選択的に分離する技術を開発することで、超希少な運動性放線菌を取得し、遺伝資源として保全を行うことを目的とする。
我々は従来法である「再水和－遠心沈殿法(Hayakawa et al., 2000)」とは原理を異にする「バルク土壌浸漬法」の開発を行った。これはタッパーに入れた土壌を水で潅水させ、誘引剤を含むろ紙に浸漬させ、ろ紙を通過する運動性放線菌のみを選択的に分離する方法である。従来法と比べ、２つの大きなポイントがある。１つ目は遠心を用いないため野外でも分離が可能であり、２つ目は従来法の分離源土壌を１gとすると数百グラム単位（数百倍）の分離源から探索を掛けることができる。
過去にミャンマーで行った試験結果と今回、新たに日本を追加し、総計 6 地点の土壌より本法を用いて運動性放線菌を分離し、16S rDNA 解析により属種の同定を行った結果、アクチノプラネス属をはじめ、カテヌロプラネス属やキネオスポリア属など計 8 属 32 種といった多様な運動性放線菌が分離された。また、新種に推定される菌株が高い割合（58%）で分離された。分離した運動性放線菌について、0.1%スキムミルクを含む 5 mM CHES buffer (pH 9.0）への化学走性を調べた結果、様々な運動性放線菌が正の化学走性を示すことがわかった。一方、ろ紙のほかにメンブランフィルターを用いた「バルク土壌浸漬法」を行ってみたところ、口径の違いにより運動性放線菌の存在比率が異なることが分かった。口径が大きければ非運動性放線菌の割合が増し、小さくすることで割合が上がった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
2019-20年度の目標はろ紙を用いた運動性放線菌の選択分離法としている。2019年度はろ紙を用いた運動性放線菌の選択分離法の構築に向けた様々な条件設定を行った。まず、ろ紙を入れる手順を検討した。土壌を水で浸漬させてから乾いたろ紙を挿入すると、非運動性放線菌を含む多量の放線菌がろ紙内に混入してきた。次いで、溶液が入った状態のろ紙を予め浸漬させた土壌に挿入することで、ろ紙外からの流入が少なくできることが分かった。次いで、ろ紙やメンブランフィルターの口径の違いによって運動性放線菌の選択性が得られるかを検証した。その結果、運動性放線菌の通過性が高いのはろ紙であり、メンブランフィルターは低かった。また、メンブランフィルターは一般細菌の通過性がろ紙の約5-10倍は高かった。メンブランフィルターは口径の違う２種類を用いて、分離された放線菌の比較を行った結果、直径10マイクロメーターではストレプトマイセス属やキネオスポリア属が比較的多く検出された。一方、5マイクロメーターではアクチノプラネス属の特定の種が選択的に分離されることが分かった。しかしながら、バクテリアの混入性と運動性放線菌の多様性を勘案すると、ろ紙が最も良いと選択基材であると思われる。2020年度はバクテリアの混入比率をさらに低下させつつも、運動性放線菌の生育には支障をきたさない抗生物質を選択する予定である。
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| 今後の研究の推進方策 |
コロナの影響で実験室での実験は若干の遅れは生じているが、抗生物質の候補選択に多くの時間を費やすことで来たので、コストパフォーマンスの高い選択培地の開発を目指している。抗生物質はβ-ラクタム系、アミノグリコシド系、アミノヌクレオシド系、キノロン系(オールドキノロン)、キノロン系(ニューキノロン)、グリシルサイクリン系、グルタルイミド系、テトラサイクリン系、ヌクレオシド系、マクロライド系から各5-10候補を挙げ、作用機序と価格、取り扱いのし易さなどを調査した結果、リボソームをターゲットとしたアミドグリコシド系が構造多様性の観点からも興味深く、現在、10化合物についてアクチノプラネス属基準株15株について耐性試験を行う予定である。また、ゲノム解析が行われているアクチノプラネス属基準株については薬剤耐性遺伝子の有無やリボソーム蛋白質遺伝子の系統解析を行い、実際の耐性能との比較を行う。次いで、耐性が確認できた抗生物質についてはろ紙を用いた分離法に供試し、不要なバクテリアの出現抑制が行えているかを評価する。
アミドグリコシド系抗生物質で思うような選択性が出せなかった場合は、キノロン系の抗生物質について評価を行うこととする。キノロン系抗生物質については既に10化合物の選択が終わっている。
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