| 研究課題/領域番号 |
19K06092
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| 研究機関 | 大阪府立大学 |
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研究代表者 |
原島 小夜子 大阪府立大学, 理学(系)研究科(研究院), 非常勤研究員 (50570032)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | オオミジンコ / 内分泌撹乱物質 / 酵母レポーターアッセイ法 / 脱皮ホルモン / 幼若ホルモン |
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| 研究実績の概要 |
化学物質の内分泌撹乱性・毒性の指標としてオオミジンコの繁殖試験(脱皮回数、産仔数、仔虫の性比)が採用されている。この手法は化学物質の個体への影響を直接的に判別する手法であるが、非常に煩雑で熟練の技術が必要であり、供試のためのオオミジンコの前培養期間を含めると、３週間から１ヶ月程度と長い時間を要する。また、実施可能な研究機関が限定されているのが現状である。本研究ではオオミジンコに対する内分泌撹乱物質の標的であり、繁殖に重要な脱皮ホルモン受容体(EcR-USP)および幼若ホルモン受容体(Met)を発現する遺伝子組換え酵母を作製し、環境試料中のそれぞれの受容体のリガンド物質を簡便・迅速（２日）・安価に検出できるレポーターアッセイ系を創出する。
本年度は、それぞれの受容体発現プラスミドと転写共役因子SRC発現プラスミドを構築して、オオミジンコのEcR-USPとMetを発現する遺伝子組み換え酵母株をそれぞれ作製した。オオミジンコEcR-USPとMet発現酵母株の樹立にあたり、それぞれの受容体に最適な応答配列を決定できるか否かが重要であった。EcR-USPは10種類以上の各種核内受容体応答配列の中から１種類で、Metは昆虫類で共通の標的である変態抑制遺伝子Kruppel homolog-1上流の応答配列を用いることで、リガンドに対する応答が確認された。これらの酵母株は代表的な既知リガンドに対して濃度依存的な応答を示し、オオミジンコEcR-USPおよびMetのリガンド物質の検出が可能なレポーターアッセイ系の確立が完了した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
それぞれの受容体に最適な応答配列を決定できるか否かでリガンドの検出系の構築の可能性が左右される。EcR-USPは10種類以上の各種核内受容体応答配列の中から１種類で、Metは昆虫類で共通の標的である編隊抑制遺伝子Kruppel homolog-1上流の応答配列を用いることで、代表的なリガンドに対する応答が確認された。それぞれの受容体のリガンド物質を検出可能なレポーターアッセイ系が確立できたことで、今後、非脱皮ホルモン様、非幼若ホルモン様構造を持つ化学物質のうち、オオミジンコに対する内分泌攪乱性が疑われる物質のハイスループットスクリーニングや環境試料中のリガンド物質の検出への応用が可能となる。
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| 今後の研究の推進方策 |
構築したオオミジンコEcR-USPおよびMetのリガンド物質を検出する酵母レポーターアッセイシステムを、非脱皮ホルモン様、非幼若ホルモン様構造を持つ化学物質のうち、オオミジンコに対する内分泌攪乱性が疑われる物質のハイスループットスクリーニングや環境試料中のリガンド物質の検出に応用する。また、オオミジンコ生体内でのMetの標的遺伝子は未だ明らかにされていない。本研究で確立したレポーターアッセイ系をオオミジンコ固有の応答配列の同定にも利用し、生体内での幼若ホルモンとMetを介したシグナル伝達経路の解明にも寄与したい。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
EcR, USP,MetおよびSRCのサブクローニング・クローニングが予想以上に早く完了したため、当初計上していた遺伝子組換え実験への支出（外注シーケンス費用を含む）が予定より抑えられた。今年度は、国内外で複数の成果発表を予定しているため、その旅費として支出する。また、英語論文の校正、出版の費用としても支出する。
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