| 研究課題/領域番号 |
19K06092
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| 研究機関 | 大阪府立大学 |
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研究代表者 |
原島 小夜子 大阪府立大学, 理学(系)研究科(研究院), 客員研究員 (50570032)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | オオミジンコ / 内分泌撹乱物質 / 酵母レポーターアッセイ法 / 脱皮ホルモン / 幼若ホルモン |
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| 研究実績の概要 |
オオミジンコは化学物質に対する感受性が高く、環境指標生物として世界中で水溶性化学物質の安全性試験に用いられている。本研究ではオオミジンコに対する内分泌撹乱物質の標的であり、繁殖に重要な脱皮ホルモン受容体(EcR-USP)および幼若ホルモン受容体(Met)を発現する遺伝子組換え酵母を作製し、環境試料中のそれぞれの受容体のリガンド物質を簡便・迅速(2 日)・安価に検出できるレポーターアッセイ系を創出した。
今年度は、昨年度に引き続き、酵母レポーターアッセイを利用したオオミジンコ生体内でのMetの新規応答配列の探索を行った。先行研究で報告のあったオス化誘導条件下で発現上昇する転写因子に着目し、それらの遺伝子の上流域のE-box (CACGTG、Metの結合配列)を含む配列をレポータープラスミドに組み込みMet発現酵母に導入したところ、二つの遺伝子に由来する配列で幼若ホルモン(JH)依存的なレポーター活性を示した。また、オオミジンコ個体内でこれらの遺伝子は早期JH応答遺伝子であることが示された。
当初の計画では、アッセイ酵母の応答が低い場合は薬剤排出ポンプ(PDR5, PDR10)および細胞壁最外層のマンナンタンパク(CWP1, CWP2)遺伝子を欠損させ、アッセイの高感度化を図る予定であったが、動物細胞を宿主としたレポーターアッセイ系と遜色ない感度を示すことから、変異導入実験は取りやめ、これまで野生株で樹立したアッセイ酵母を最終形態とし、各種実験が可能であると判断した。
一方、当初の計画にはなかったが、今年度はUSP発現酵母株の作製も行い、各種リガンドのアッセイにより、ヒトホモログであるRetinoid X receptor (RXR)発現酵母株との応答の比較も行った。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
今年度は、昨年度に引き続き酵母レポーターアッセイ法を利用したオオミジンコ生体内でのMetの新規応答配列の探索を行った。先行研究でオス化誘導条件下で発現上昇すると報告された転写因子に着目し、それらの上流域のE-boxを含む配列をレポータープラスミドに組み込んでMet発現酵母に導入した。その結果、二つの遺伝子に由来する配列で幼若ホルモン(JH)依存的なレポーター活性を示した。また、オオミジンコ個体内でこれらの遺伝子は早期JH応答遺伝子であることが示された。昨年度の成果と併せて、これまで不明であったオオミジンコ生体内での標的遺伝子の候補が複数確認され、酵母レポーターアッセイ法での応答配列の探索が有用であることを示唆する成果であると言える。
また当初の計画にはなかったが、今年度はUSP発現酵母株の作製も行い、各種リガンドのアッセイにより、ヒトホモログであるRetinoid X receptor (RXR)との応答の比較も行った。
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| 今後の研究の推進方策 |
これまでに構築したEcR-USPおよびMet発現酵母を用いて、オオミジンコへの内分泌かく乱性が疑われる、非脱皮ホルモン様・非幼若ホルモン様構造を有する物質のリガンド活性を確認する。また、Metについては応答配列による各種リガンドへの応答を比較し、オオミジンコ生体内での幼若ホルモンとMetを介したシグナル伝達経路の解明にも寄与したい。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
前年度に引き続いて、新型コロナウイルス感染拡大のために、研究活動が大きく制限された時期があった。可能な限り研究活動を続けたものの、物品購入費は大きく減少した。また、各種学会がオンライン開催になったため、旅費の支出は全くなかった。次年度使用額は、研究成果を英語論文にまとめるための校正、出版費用に充てる。また、新たに同定したMet応答配列の特徴をさらに詳細に調べたり、オオミジンコに対する内分泌かく乱性が疑われる非脱皮ホルモン様・非幼若ホルモン様物質のスクリーニングを行うため、各種リガンドや遺伝子組換え実験に必要な物品・オリゴDNAの購入および外注DNAシーケンスなどの費用に充てる。
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