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2020 年度 実施状況報告書

きのこβ-1,6-グルカンを認識する新規受容体の同定

研究課題

研究課題/領域番号 19K06166
研究機関宇都宮大学

研究代表者

金野 尚武  宇都宮大学, 農学部, 准教授 (60549880)

研究期間 (年度) 2019-04-01 – 2022-03-31
キーワードきのこ / β-グルカン
研究実績の概要

きのこ類に含まれるβ-1,6グルカンは免疫活性化機能を持つ。しかしながら、きのこ類からの単離・精製は困難である。マクロファージ様細胞(RAW264.7)からのβ-1,6-グルカン受容体を同定するためには、純粋なβ-1,6グルカンの調製が必要である。そこで、2つの手法でβ-1,6グルカンの取得を進めた。一つ目の手法として、真菌類からβ-1,6グルカンを抽出した。シイタケおよびイワタケの子実体から熱水抽出物またはアルカリ抽出物を調製し、エタノール沈殿等で高分子画分を得た。さらに、β-1,3-グルカナーゼで処理することで、β-1,3-グルカン部分を除去した。得られた生成物が基質特異性の高いβ-1,6-グルカナーゼで酵素分解されることを確認した。よって、β-1,6-グルカンであると考えられ、β-1,6-グルカンオリゴ糖の調製も可能であることを示すことができた。2つ目の手法として、β-1,6グルカン分解酵素(グルカナーゼ)の合成酵素への変換を行った。スエヒロタケ(Schizophyllum commune)およびウシグソヒトヨタケ(Coprinopsis cinerea)由来のβ-1,6-グルカナーゼのれぞれ活性中心残基のグルタミン酸をグリシン、アラニン、セリンにそれぞれ変換し得られた合成酵素を作成し、リコンビナントタンパク質をこうじ菌を用いて異種発現させ精製した。。得られた酵素をそれぞれ100mM酢酸ナトリウムバッファー(pH5.0)、20mMフッ化ゲンチオビオース、20℃、48hの条件で反応させた。生成物を検出したところ、収量は少ない物の2糖以上のオリゴ糖と多糖が検出でき、β-1,6-グルカンの合成に成功したと考えられた。現在、得られた生成物の構造解析とRAW264.7を用いた機能性評価を進めている。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

2020年度は細胞培養試験、大量培養を進める予定であったが、新型コロナウイルスの感染拡大防止への対応のため、研究室の部分的な閉鎖があり、細胞培養についての継続的な実験ができなかった。そのため、材料であるβ-グルカンの調製を中心に行った。

今後の研究の推進方策

2020年度までの実験で調製することができたβ-1,6-グルカンを用い機能性試験行う。β-1,3-グルカン、β-1,6-グルカンおよびβ-1,3/1,6-グルカンでそれぞれ処理したRAW264.7細胞を回収し、RNAシークエンスを行う。発現している遺伝子群を比較することでβ-1,6-グルカン受容体の同定につなげる。また、大量培養した細胞からタンパク質群を抽出し、β-1,6-グルカン結合能を持つタンパク質を各種クロマトグラフィーを用いて精製する。

次年度使用額が生じた理由

コロナ禍の影響から実験の制限を余儀なくされ、細胞培養試験などが予定通りに実施できなかった。また、実験補助員の雇用、研究発表用の旅費などの支出も制限されたため、次年度使用額が生じている。

  • 研究成果

    (4件)

すべて 2021 2020

すべて 雑誌論文 (3件) 学会発表 (1件) (うち招待講演 1件)

  • [雑誌論文] Screening of a Lentinula edodes Mutant That Retains Lentinan Contents Long after Being Harvested Using TILLING2021

    • 著者名/発表者名
      Sakamoto Yuichi、Sato Shiho、Nakade Keiko、Ito Miyuki、Yamauchi Takahiro、Eda Katsumasa、Goto Fumikazu、Mizuno Masashi、Konno Naotake
    • 雑誌名

      ACS Agricultural Science & Technology

      巻: - ページ: -

    • DOI

      10.1021/acsagscitech.0c00023

  • [雑誌論文] Non-destructive analysis of the moisture content in shiitake mushrooms (Lentinula edodes) using near-infrared imaging at 1450?nm2020

    • 著者名/発表者名
      Shinoda Kazuma、Konno Naotake、Suzuki Tomohiro
    • 雑誌名

      Mycoscience

      巻: 61 ページ: 235~239

    • DOI

      10.1016/j.myc.2020.04.005

  • [雑誌論文] Starch-degrading enzymes from the brown-rot fungus Fomitopsis palustris2020

    • 著者名/発表者名
      Tanaka Yuki、Konno Naotake、Suzuki Tomohiro、Habu Naoto
    • 雑誌名

      Protein Expression and Purification

      巻: 170 ページ: 105609~105609

    • DOI

      10.1016/j.pep.2020.105609

  • [学会発表] 水環境下における多糖類の酵素分解2020

    • 著者名/発表者名
      金野尚武
    • 学会等名
      第69回高分子討論会
    • 招待講演

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公開日: 2021-12-27  

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