| 研究課題/領域番号 |
19K06212
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| 研究機関 | 福井県立大学 |
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研究代表者 |
近藤 竜二 福井県立大学, 海洋生物資源学部, 教授 (30244528)
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| 研究分担者 |
片岡 剛文 福井県立大学, 海洋生物資源学部, 准教授 (10533482)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 鞭毛虫 / 嫌気性 / 底泥 |
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| 研究実績の概要 |
福井県の三方五湖の一つである日向湖の底泥から、集積培養と段階希釈法により偏性嫌気性の原生生物が単離された。光学顕微鏡観察のほか、細胞形態を走査型電子顕微鏡で観察するとともに、細胞内の微細構造を透過型電子顕微鏡で観察したところHeteroloboseaに特徴的な形質が認められたが、一部にはこの鞭毛虫にしかないような特徴が認められた。食胞を有し、その内部には摂食した原核微生物の存在が認められた。また、DAPIを用いて核酸を染色したのち蛍光顕微鏡で観察したところ、食胞内に核酸が認められたことから、原核微生物を摂食していることが明らかとなった。
細胞からDNAを抽出し、それを鋳型にして18S rRNA遺伝子をPCR増幅するとともに、全RNAを鋳型とした逆転写PCRによっても18S rRNA遺伝子を増幅した。それらの塩基配列を決定し、Blastによる検索ならびに系統解析を行ったところ、Heteroloboseaのクレードに属することが示されたものの、近縁な種は全く存在しなかった。さらにRNAシーケンスによってα-tubulin、β-tubulin、hsp90の各遺伝子の塩基配列を決定し、18S rRNA遺伝子とともに連結分子系統解析を行ったところ、単離株はHeteroloboseaに属することが示されたものの、形態的な特徴と遺伝子解析から全く新奇な原生生物で、少なくとも属レベルで新しいことが示された。
この鞭毛虫の生理・生化学的性質を調べるために、共存する原核微生物を極力少なくする必要があり、抗生物質と限界希釈を併用した培養を行った。その結果3種類の細菌しか混在しない培養を得ることができた。現在、この培養を用いて増殖至適温度と塩分濃度、各種有機物分解活性、細菌摂食活性を明らかにした。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
当初の予定であった無菌培養あるいは二者培養を確立するために、抗生物質を併用しながら植え継ぎを繰り返した。その原生生物の培養液中の細菌叢を解析した結果、Firmicutes細菌、Desulfovibrio属細菌、Bacillus属細菌の３種類で構成されていることが明らかとなった。このうちFirmicutes門細菌とDesulfovibrio属細菌の単離に成功した。予めこの細菌株を培養し、これらに単離した原生生物を接種すると安定して培養を維持することが可能となった。この条件での至適増殖温度と塩分濃度を明らかにすることが出来たが、共存する細菌のため酵素活性や細菌摂食活性の正確な測定ができなかった。
この他、単離したFirmicutes門細菌とDesulfovibrio属細菌の16S rRNA遺伝子の塩基配列を決定し、Blast検索を行ったところ、少なくとも前者は属レベルで、後者は種レベルで新しい種類の細菌であることが示唆されたので、これらの細菌株の分類学的位置について検討している。
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| 今後の研究の推進方策 |
単離した2種類の細菌を用いて、それらを単独も餌として培養し、抗生物質とともに鞭毛虫を添加することを繰り返して二者培養の確立を目指す。確立した培養系を用いて正確な至適増殖温度・塩分などの増殖特性と細菌摂食活性ならびに各種有機物の分解活性を調べる。
さらに嫌気性マイクロコズムを作成するための方法について検討する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
無菌培養または二者培養を確立することが出来なかったため、生理・生化学的特徴の一部を調べることが出来なかった。次年度はこれらの研究に使用する試薬の購入に充てる。
また、培養液中から得られた細菌株が新種である可能性が高いので、この株の分類学的位置を明らかにするための研究に予算の一部を充てる。
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