2019 年度実施状況報告書

甲殻類の免疫反応と遷移金属元素の関係

研究課題

研究課題/領域番号	19K06221
研究機関	京都大学
研究代表者	増田太郎京都大学, 農学研究科, 助教 (40395653)
研究期間 (年度)	2019-04-01 – 2022-03-31
キーワード	フェノールオキシダーゼ / ヘモシアニン / チロシナーゼ / 銅タンパク質 / メラニン形成
研究実績の概要	食用甲殻類の黒変反応は、甲殻類体液中のチロシンなどフェノール性水酸基を有する化合物を出発物質としたメラニン形成によるものである。本反応の初期・律速段階は、銅含有酵素であるフェノールオキシダーゼが触媒するが、類縁タンパク質であるヘモシアニンが反応に関与する可能性も指摘されている。2019年度は、タイプ3銅タンパク質に分類されるフェノールオキシダーゼ（血球型および分泌型）とヘモシアニンの黒変現象への寄与を明らかにすることを目的として研究に着手した。その結果、甲殻類体液中のフェノールオキシダーゼ, ヘモシアニンは、ともに分子量約7,5000のサブユニットからなる六量体を形成し、紫外可視吸収スペクトルによりオキシ型の二核銅中心を含むことが示唆された。体液中のフェノールオキシダーゼ活性の本体は、クルマエビでは分泌型フェノールオキシダーゼ、イセエビでは血球型フェノールであった。酸素運搬タンパク質であるヘモシアニンは種を問わず甲殻類体液中に20mg/ml以上の高濃度で存在する上、フェノールオキシダーゼと立体構造が類似していることから既報の精製法で両者を分離することは困難であった。精製ヘモシアニン単独では活性化処理を施した場合も活性を持つには至らなかったことから、甲殻類体液中のフェノールオキシダーゼ活性はヘモシアニンではなく微量に含まれるフェノールオキシダーゼに由来するものであると結論した。また、フェノールオキシダーゼ、ヘモシアニンの活性の差異をもたらす分子機構を明らかにするため、食用甲殻類（イセエビ）由来のヘモシアニンについてX線結晶構造解析を行った。その結果、高分解能(1.58Å)の立体構造解析に成功し、活性中心の詳細な立体構造と全体構造を明らかにした。報告者らが明らかにしたフェノールオキシダーゼの構造と比較することにより、両者の活性の差異について検討を開始した。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 1: 当初の計画以上に進展している理由現在、甲殻類の黒変現象の原因タンパク質として、フェノールオキシダーゼとヘモシアニンが挙げられている。近年の研究から後者のヘモシアニンの寄与率が高いとされてきた。しかし、報告者らはヘモシアニンと分離困難な新規フェノールオキシダーゼを見出すなど、近年の研究例にヘモシアニン、フェノールオキシダーゼの誤認があることを明らかにした。更に、以前の科学研究費補助金による研究助成で明らかにした甲殻類フェノールオキシダーゼの立体構造に続き、本年度は甲殻類ヘモシアニンの高分解能立体構造解析に成功した。甲殻類由来ヘモシアニンの立体構造解析について、これまでに低分解能の解析例が一例あるのみで、活性中心付近の詳細な立体構造を明らかにしたのは本研究が世界初の例である。これらの成果は、両タンパク質の機能的差異に関する分子レベルでの理解を可能とすると考えられる。以上より、本研究は当初の計画以上に研究が進展していると考えている。
今後の研究の推進方策	2019年度に明らかにしたヘモシアニンの立体構造とすでに得ているフェノールオキシダーゼの立体構造を詳細に比較することにより、両者の活性の差異について検討する。また、フェノールオキシダーゼは通常不活性なプロ型として生合成される。酵素活性の発現には特定の条件での活性化が必要であるため、活性化条件での構造変化、即ちプロ型と活性型との構造変化について、種々の分光法を用いて解析する。また、フェノールオキシダーゼ、ヘモシアニンは、共に銅を含む非常に類似した活性中心を有する。これらの活性中心の形成を補助する因子についてその解明を試みる。
次年度使用額が生じた理由	本申請課題の一年目は、甲殻類ヘモシアニンのX線結晶構造解析が予想外に進捗したため、生鮮試料の購入と試料採取・確保のための出張と新規の遺伝子工学研究試薬キットなどの購入が当初見込みよりも少なくなった。そのため、次年度使用額が生じたが、研究計画の進捗は当初の計画以上と考えている。 2020年度は、予定通り計画に沿って研究を進める。