| 研究課題/領域番号 |
19K06340
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| 研究機関 | 福井県立大学 |
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研究代表者 |
伊藤 貴文 福井県立大学, 生物資源学部, 教授 (10402827)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | chitin / chitobiose-binding / histidine kinase sensor / two-component system |
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| 研究実績の概要 |
キチンなどの多糖は、生物が作る再生可能な資源である。本研究では、その有効利用のために、「Paenibacillus属細菌によるキチン分解の制御機構の解明」を行っている。本年度は、キチン分解に関わる遺伝子の発現を制御する機構 (二成分制御系) の解析に関して、下記のことを行った。
(1) 二成分制御系タンパク質の調製
昨年度、キチンを酵素によって分解して生じる2糖をPaenibacillus属細菌FPU-7株細胞表層で補足するタンパク質 (キチン2糖結合タンパク質NagB1とNagB2) の解析を行った。そして、NagB1遺伝子近傍に、キチンの存在を検知すると予想される二成分制御系タンパク質NagS (センサータンパク質) とNagR (レスポンスレギュレーター) の遺伝子を検出した。そこで、本年度は、それらの組換えタンパク質の調製を検討した。NagRに関しては、機能解析に十分な量が調製されたが、NagSに関しては、その全長タンパク質が微量にしか得られなかった。次に、NagSがドメイン構造を形成することを見出し、細胞外でセンサードメインとして働くと予想されるタンパク質のみ (NagS30-294) の調製を検討した。結果、機能解析に十分な量のNagS30-294タンパク質を取得した。
(2) 二成分制御系細胞外センサードメインの機能解析
二成分制御系細胞外センサードメインであるNagS30-294に関して、キチン2糖を含む様々な糖質との相互作用を示差走査蛍光定量法によって、解析したところ、NagSがキチン2糖と直接結合せず、キチン2糖結合タンパク質 (NagB1) を介して、キチン2糖に応答することが示唆された。今後、NagSとNagB1との相互作用の解析を行う。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
本年度、当初の研究計画の通りに進めていたが、二成分制御系タンパク質のうち、センサータンパク質NagSに関して、機能解析に十分な量の調製の検討に時間を要した。キチン分解に関わる遺伝子の発現制御に関する研究に関しては、レスポンスレギュレータータンパク質NagRの調製にとどまった。論文発表の成果発表は行えたが、新型コロナウイルスの影響により、学会での発表は十分に行うことができなかった。下記の成果が得られた。
(1) 二成分制御系タンパク質の調製
キチンの存在を検知すると予想される二成分制御系タンパク質NagSとNagRの組換えタンパク質の調製を検討した。NagS全長タンパク質は微量にしか取得されなかったが、細胞外でセンサードメインとして働くと予想されるタンパク質のみ (NagS30-294) に関しては、機能解析に十分な量のタンパク質を取得した。一方、NagRは、機能解析に十分な量が調製された。
(2) 二成分制御系細胞外センサードメインの機能解析
NagS30-294に関して、キチン2糖を含む様々な糖質との相互作用を示差走査蛍光定量法によって、解析したところ、キチン2糖と直接結合しないことが示唆された。
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| 今後の研究の推進方策 |
下記、交付申請書に記載した通り、研究を進めていく。
(1) キチン分解に関わる遺伝子の発現を制御する機構の解析 (二成分制御系の解析): P. str. PFU-7の一部のキチン分解酵素は、キチン2糖によって発現が誘導される。これまでにキチン2糖結合タンパク質 (NagB1) 近傍の配列に遺伝子発現制御系の一つである二成分制御系のタンパク質複合体 (NagSとNagR) を見出し、NagS細胞外ドメインタンパク質 (NagS30-294) とNagRの組換えタンパク質を調製した。今後、NagS30-294とNagB1との相互作用の解析を行う。また、NagB1とNagZと二成分制御系 (NagSとNagR) がキチン2糖をシグナルとして協奏的に機能を果たしているのか、RT-PCRによる転写解析およびウエスタンブロッティングによる翻訳解析によって確認する。さらに、NagR (レスポンスレギュレーター) が相互作用する塩基配列をクロマチン免疫沈降法によって網羅的に同定する。そして、P. str. FPU-7あるいは近縁種を有用物質の生産菌として利用できるように、タンパク質の発現制御法への展開を図る。
(2) 細胞表層発現タンパク質の網羅的解析: P. str. FPU-7の細胞表層に存在するタンパク質を質量分析装置を利用して網羅的に同定する。二成分制御系以外にも、キチン分解やその制御に関わるタンパク質を探索する。また、同時に細胞壁の構築や細胞増殖に関わるタンパク質の知見も得られることも予想され、P. str. FPU-7や近縁種による有用物質の効率的な生産方法の確立にも期待される。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本年度、当初の研究計画のとおりに進めていたが、新型コロナウイルスの影響により、キチン分解に関わる遺伝子の発現を制御する機構の解析や、学会での成果の発表を十分に行うことができず、次年度での使用が生じた。2022年度物品費として利用する。
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