| 研究課題/領域番号 |
19K06351
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| 研究機関 | 新潟大学 |
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研究代表者 |
山田 宜永 新潟大学, 自然科学系, 教授 (40253207)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | 脂肪交雑 / 遺伝子発現 |
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| 研究実績の概要 |
黒毛和種去勢雄牛尾根部仙尾骨筋サンプルを採取し、PCR-RFLP法を用いたタイピング（遺伝子型判定）により、EDG1多型、TTN多型のそれぞれについて、3つの遺伝子型群のサンプル、高脂肪交雑形成と関連する対立遺伝子である高脂肪交雑アリル（EDG1多型ではTアリル、TTN多型ではTアリル）のホモ型群（高脂肪交雑アリルホモ型群）、低脂肪交雑アリル（EDG1多型ではGアリル、TTN多型ではCアリル）のホモ型群（低脂肪交雑アリルホモ型群）、両アリルのヘテロ型群を選抜していた。マイナーアリルのホモ型群のサンプルについては、昨年度、本年度において追加のタイピングを行い、サンプル数の増加を図った。
さらに、mRNAレベルでの発現変動との関連の解析を行うために、選抜したサンプルからトータルRNAを抽出し、リアルタイムPCRによるEDG1とTTNのmRNAレベルの定量データとタイピングデータを用いて、EDG1多型のTアリル、TTN多型のTアリルが、それぞれEDG1のmRNAレベルでの発現増加、TTNのmRNAレベルでの発現減少と関連するという結果を得ていた。また、タンパク質レベルでの発現変動との関連の解析を行うために、選抜したサンプルからライセートを調製し、ウェスタンブロッティングによるEDG1とTTNのタンパク質レベルの定量データとタイピングデータを用いて、EDG1多型のTアリル、TTN多型のTアリルが、それぞれEDG1のタンパク質レベルでの発現増加、TTNのタンパク質レベルでの発現減少と関連するという予備的な結果を得ていた。
本年度、追加サンプルの追加解析を行い、関連について確認した。また、転写活性および核タンパク質結合性の解析のための詳細なプロトコールを検討するとともに、トランスフェクション法およびライセート調整の予備検討を行った。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
本研究では、EDG1遺伝子、TTN遺伝子のプロモーター領域に位置するDNA多型（EDG1多型、TTN多型）を、それぞれの遺伝子の発現変動の原因変異として同定するために、サンプルの採取・選抜を行い、選抜サンプルを利用することで、mRNAレベルでの発現変動との関連の解析、タンパク質レベルでの発現変動との関連の解析、転写活性に対する影響の解析、核タンパク質との結合性に対する影響の解析といった機能解析を行うという計画になっている。現時点では、mRNAレベルおよびタンパク質レベルでの発現変動との関連の解析において、EDG1遺伝子、TTN遺伝子のマイナーアリルのホモ型群のサンプルを含めた確証実験でも、当初予想していた通りの結果がえられたという状況にある。
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| 今後の研究の推進方策 |
転写活性に対する影響の解析（レポーター遺伝子解析）により、EDG1多型のTアリル、TTN多型のCアリルに対応するプロモーター領域が、それぞれEDG1多型のGアリル、TTN多型のTアリルに対応するものより高い転写活性を示し、EDG1多型、TTN多型が、それぞれの遺伝子の転写活性に影響することを明らかにする。また、核タンパク質との結合性に対する影響の解析（ゲルシフト解析）により、EDG1多型、TTN多型のそれぞれについて、2つのアリルに対応するDNA領域の比較で結合核タンパク質レベルに差がみられ、高脂肪交雑アリルホモ型群と低脂肪交雑アリルホモ型群の核抽出液の比較では、結合核タンパク質レベルに差がみられないことを明らかにする。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本年度、マイナーアリルのホモ型群のサンプル数を増加させ、追加解析を行うとともに、今後の解析のためのトランスフェクション法およびライセート調製について予備検討を行ったが、コロナの影響により、研究が十分に実施できなかった。
そのため、次年度、検討したプロトコールや実験法に基づき以下の解析を行う。
転写活性に対する影響の解析（レポーター遺伝子解析）により、EDG1多型のTアリル、TTN多型のCアリルに対応するプロモーター領域が、それぞれEDG1多型のGアリル、TTN多型のTアリルに対応するものより高い転写活性を示し、EDG1多型、TTN多型が、それぞれの遺伝子の転写活性に影響することを明らかにする。また、核タンパク質との結合性に対する影響の解析（ゲルシフト解析）により、EDG1多型、TTN多型のそれぞれについて、2つのアリルに対応するDNA領域の比較で結合核タンパク質レベルに差がみられ、高脂肪交雑アリルホモ型群と低脂肪交雑アリルホモ型群の核抽出液の比較では、結合核タンパク質レベルに差がみられないことを明らかにする。
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