2019 年度実施状況報告書

DNAメチル化可変部位を指標としたウシ精子・受精卵の受胎性評価システムの構築

研究課題

研究課題/領域番号	19K06362
研究機関	国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構
研究代表者	武田久美子国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 畜産研究部門家畜育種繁殖研究領域, 上級研究員 (60414695)
研究分担者	小林栄治国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 畜産研究部門, ユニット長 (00186727)
研究期間 (年度)	2019-04-01 – 2022-03-31
キーワード	ウシ / 精子 / 人工授精 / 受胎率 / DNAメチル化 / 全ゲノムバイサルファイトシークエンス
研究実績の概要	ウシ人工授精において精液性状検査による評価結果が良好でも受胎性の低い精子が存在している。我々は、受胎性の新たな指標として環境要因で変化しうるエピゲノム情報としてDNAメチル化レベルの変化に注目し、加齢や受胎性へ関連するウシの精子核DNAメチル化可変領域(DMRs)をいくつか明らかにしてきた。本課題では、次世代シークエンスを利用した受胎性の異なる精液のメチル化レベルの網羅的比較分析から指標となり得るDMRsを選択し、複数のDMRsを指標としたウシ凍結精液の受胎性予測法を開発することを目的としている。本年度は、人工授精後の受胎率が異なる黒毛和種種雄牛から採取した凍結精液サンプル２検体からDNAを精製し、全ゲノムバイサルファイトシークエンス（WGBS）解析を行った。WGBS解析により約5000万箇所のCpGのメチル化情報が得られた。次に、現在までに得られた17検体の凍結精液サンプルのヒト用マイクロアレイ解析データから受胎性に関連する100以上の候補CpGを絞り込んだ後、WGBS解析データから得られた当該CpG周辺4kbのCpGのメチル化情報を組み合わせることにより、受胎性関連メチル化可変領域(DMRs)を新たに複数検出した。また、WGBS解析データおよびマイクロアレイ解析データから抽出した候補CpGの中にSNPも一定割合含まれることが明らかとなった。引き続き、WGBS解析データおよびマイクロアレイ解析データより抽出したDMRsに対してCombined Bisulfate Restriction Analysis(COBRA)法による簡易DNAメチル化度の推定が可能なDMRsを選定した。人工授精後の受胎性の明らかな凍結精液約40検体についてCOBRA法によるDNAメチル化度の比較解析を行ったところ、人工授精後の受胎率とメチル化度が関連する候補DMRsを９箇所確認した。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 2: おおむね順調に進展している理由当初RBBS解析により受胎性の明らかに異なる精液のメチル化レベルの比較分析を行う予定であったが、予定とほぼ同価格で全ゲノムバイサルファイトシークエンス（WGBS）が可能となっていたため（１検体約30万円；ただし解析内容は限られる）、情報量が飛躍的に多いことからWGBS解析を行うこととした。人工授精後の受胎率の異なる種雄牛から1頭ずつ予定通りWGBSデータを得た。WGBSの結果から、ヒト用マイクロアレイによる比較解析により抽出した受胎性に関連のある候補CpG部位についてDNAメチル化可変領域であるかどうかの検証を行うことにより、新たに受胎性と関連する候補DMRsを効率よく複数発見できた。 2020年3月に開催予定だった日本畜産学会大会において、2演題の研究発表を予定していたが開催中止となり、結果の公表は延期となった。
今後の研究の推進方策	今年度は新たに２検体の受胎性の異なる凍結精液サンプルについてWGBS解析を行い、WGBSデータ間の比較解析を可能とする。さらに候補DMRsについて、構築したCOBRA法等による簡易検出系により、引き続き以下に示す受胎性への関連性についての検証を行う。1) 人工授精後の受胎性の明らかな凍結精液約40検体および体外受精後の胚発生率の明らかな凍結精液10検体を用いた受胎性への関連性について検証を行う。2)体外受精に用いた精子、体外受精前の成熟卵子、体外受精後の胚におけるDMRsのメチル化動態や個々のプロファイルを調査し、初期の胚発生への関与の可能性を検討する。体外受精前の卵子および、体外受精後２細胞期、４～８細胞期は複数個プールしたものから、胚盤胞期胚については１個づつからDNAを抽出しバイサルファイト処理後、解析に用いる。3)候補DMRsについてCOBRA法により簡易に測定したDNAメチル化率に基づき凍結精液の受胎性の予測を試みる。
次年度使用額が生じた理由	本年度RRBS解析を２検体で予定していたが、より大量データの得られるWGBS解析が安価となったため、そちらの解析に切り替えたことで節約が可能となった。また次年度についても同様に２～３検体のWGBS解析を予定している。 2020年3月に開催予定だった日本畜産学会大会において、2演題の研究発表を予定していたが、開催中止となったため２人分の大会参加費および旅費分を次年度に繰り越しとした。