ブタ体細胞核移植効率改善に向けたドナー細胞側のゲノム修飾効果の検討

2021 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 19K06372
• 研究機関: 国立研究開発法人国立成育医療研究センター
• 研究代表者: 佐藤 正宏 国立研究開発法人国立成育医療研究センター, ゲノム医療研究部, 共同研究員 (30287099)
• 研究分担者: 三好 和睦 鹿児島大学, 農水産獣医学域農学系, 教授 (70363611)
• 研究期間 (年度): 2019-04-01 – 2022-03-31
• キーワード: 体細胞核移植 / クローンブタ / 遺伝子改変 / DNAメチル化 / ゲノム編集 / DNAメチル化転移酵素1遺伝子 / Oct-3/4 / EGFP

研究実績の概要

本研究は、体細胞核移植（SCNT）に使用されるドナー細胞である胎仔性繊維芽細胞に対し、強制的に「幼弱化（あるいは初期化）」を誘導させ、そのような処置を施された細胞をドナーとするSCNTを試み、最終的にヒトの健康・福祉に貢献する遺伝子改変クローンブタを効率的に作製することを目指した。そのカギとなるのが、ヒストンのDNAメチル化問題である。そこで、CRISPR/Cas9法にてドナーブタ細胞ゲノム内のヒストン遺伝子群のメチル化を促す遺伝子（DNAメチル化転移酵素1, DNMT1）の破壊を試みた。ドナーブタ細胞にはSCNTの成否を判断するためのOct-3/4 promoter + EGFP（緑蛍光タンパク） cDNA遺伝子発現ユニットが予め搭載されている（これを”m4細胞”と称す）。ブタDNMT1遺伝子を標的とするgRNAを設定。これとCas9タンパクとを混ぜ、m4細胞に遺伝子導入を施した。その後、独自開発の選別系にて最終的に生存細胞株を拾った。分子生物学的解析から、その株にはDNMT1の破壊が確認された。次いで、このゲノム編集細胞株をドナーとするSCNTを行った。ドナー細胞が適切に初期化されておれば、SCNT胚の発生も単為発生胚並みに改善されると期待される。結果、クローン胚盤胞への発生率が２倍ほど改善された（~22% vs. ~43%）。更に、クローン胚でのEGFP蛍光タンパク発現が増大した。これらの点は、DNMT1遺伝子の破壊の結果、クローン胚での遺伝子発現状況が幼弱状態のそれにリセットされた可能性を示唆する。以上から、クローンブタ作製の効率化には、ヒストン遺伝子群のメチル化の阻害が重要であるという点が確認された。これにより、クローンブタ作製は加速すると期待される。そして、その効果は医学や農林水産業の振興・発展に貢献すると考えられる。

研究成果

• [雑誌論文] In vitro electroporation in the presence of CRISPR/Cas9 reagents as a safe and useful method for producing biallelic knock out porcine embryos (2021)
  • 著者名/発表者名: Sato M, Jin H, Akasaka E, Miyoshi M
  • 雑誌名: OBM Genetics 巻: 5 ページ: 15
  • DOI: 10.21926/obm.genet.2101123
  • 査読あり
• [雑誌論文] Novel reporter mouse models useful for evaluating in vivo somatic cell gene editing and for optimization of methods of delivering genome editing tools (2021)
  • 著者名/発表者名: Miura H, Imafuku J, Kurosaki A, Sato M, Ma Y, Zhang G, Mizutani A, Kamimura K, Gurumurthy CB, Liu D, Ohtsuka M
  • 雑誌名: Molecular Therapy: Nucleic Acid 巻: 24 ページ: 325-336
  • DOI: 10.1016/j.omtn.2021.03.003
  • 査読あり
• [雑誌論文] Development of a novel, pipette tip-aided cell cloning method for effective isolation of genome-edited porcine cell (2021)
  • 著者名/発表者名: Sato M, Saitoh I, Akasaka E, Inada E
  • 雑誌名: OBM Genetics 巻: 5 ページ: 16
  • DOI: 10.21926/obm.genet.2101126
  • 査読あり
• [雑誌論文] RNA analysis based on a small number of manually isolated fixed cells (RNA-snMIFxC) to profile stem cells from human deciduous tooth-derived dental pulp cells (2021)
  • 著者名/発表者名: Inada E, Saitoh I, Kubota N, Iwase Y, Kiyokawa Y, Noguchi H, Yamasaki Y, Sato M
  • 雑誌名: Biological Procedure Online 巻: 23 ページ: 12
  • DOI: 10.1186/s12575-021-00149-5
  • 査読あり
• [雑誌論文] Modification of improved-genome editing via oviductal nucleic acids delivery (i-GONAD)-mediated knock-in in rats (2021)
  • 著者名/発表者名: Aoshima T, Kobayashi Y, Takagi H, Iijima K, Sato M, Takabayashi S
  • 雑誌名: BMC Biotechnology 巻: 21 ページ: 63
  • DOI: 10.1186/s12896-021-00723-5
  • 査読あり
• [雑誌論文] Adipose tissue as a useful material for the grafting of tumorigenic cells and juvenile tissues in mice (2021)
  • 著者名/発表者名: Sato M, Kiyokawa Y, Inada E, Akasaka E, Watanabe S, Saitoh I
  • 雑誌名: OBM Transplantation 巻: 5 ページ: 4
  • DOI: 10.21926/obm.transplant.2104155
  • 査読あり
• [雑誌論文] Tissue-nonspecific alkaline phosphatase, a possible mediator of cell maturation: Towards a new paradigm (2021)
  • 著者名/発表者名: Sato M, Saitoh I, Kiyokawa, Iwase Y, Kubota N, Ibano N, Noguchi H, Yamasaki Y, Inada E
  • 雑誌名: Cells 巻: 10 ページ: 3338
  • DOI: 10.3390/cells10123338
  • 査読あり