| 研究課題/領域番号 |
19K06397
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
平松 竜司 東京大学, 大学院農学生命科学研究科(農学部), 助教 (70555284)
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| 研究分担者 |
金井 克晃 東京大学, 大学院農学生命科学研究科(農学部), 准教授 (30260326)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | マウス / 卵巣 / 性分化 / トランスクリプトーム解析 |
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| 研究実績の概要 |
次世代の生命をつなぐ配偶子を形成する生殖腺は生殖細胞と体細胞から成り、その相互作用が配偶子形成に必須であることから、生殖腺の体細胞に関する理解は配偶子形成機構の解明において必須となる。しかしながら、形態的変化の乏しい胎子卵巣分化機構、特に卵胞上皮細胞などの体細胞分化についてはいまだ多くがベールに包まれている。我々はこれまでに、卵巣の支持細胞において、生後すぐの最初の卵胞形成や卵巣髄質領域の卵巣間質腺の形成に関与している特殊な支持細胞系譜存在があることを明らかにしており、これらの体細胞個別の細胞系譜の多様性（heterogeneity）を考慮することが、卵巣分化過程を解明するうえで強く求められる。そこで2019年度の本研究では、胎子卵巣支持細胞の性的不均一性の分子基盤と性的2型の破綻の分子機序を解明することを目的として、胎子卵巣での一細胞トランスクリプトーム解析、ならびに体細胞系譜サブタイプのクラスタ解析・統計学的解析を行った。その結果、以下の結果が得られた。①生殖細胞集団と体細胞集団でそれぞれ発現が特徴的な遺伝子が確認できた、②性決定後の雌の生殖腺発生における既知の細胞集団であるFoxl2陽性、Lgr5陽性、Nr2f2陽性の細胞集団においてそれぞれ特徴的に発現する遺伝子を見出した、③Foxl2陽性細胞集団で発現に不均一性がみられる遺伝子を見出した、④それらの遺伝子のうち、Foxl2陽性、Lgr5陽性の細胞集団で特徴的に発現がみられた遺伝子について、in situ hybridizationを用いて胎子卵巣組織における発現パターンの解析を行い、いくつかの遺伝子においては実際の卵巣組織での発現が確認された、⑤lncRNAなどの発現も上位に上がってくることが確認された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究では2019年度並びに2020年度において、胎子卵巣の一細胞トランスクリプトーム解析による胎子卵巣体細胞系譜のサブタイプ間の遺伝子発現の比較検討と体細胞系譜のサブタイプ特異的に有意に発現が変化している遺伝子の抽出、卵巣分化過程における発現パターン解析を予定しており、研究実績にある通り、それらの解析についておおむね順調に進展している。また、他の論文で得られているRNA-Seqデータや公共データベースに加え、新たに生殖腺におけるRNA-Seqデータも得ており、それらを活用することで、キーファクターとなる遺伝子のさらなる絞り込みを行なっている。以上のことから、2019年度の本研究は当初計画通り順調に進展していると考えられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
2019年度に実施した胎子卵巣の一細胞トランスクリプトーム解析、および遺伝子発現プロファイルの統計学的解析により得られた結果より、以下の研究を伸展する。
実験１）胎子卵巣体細胞系譜のサブタイプ間の遺伝子発現の比較検討と卵巣分化過程における発現パターン解析：①Foxl2陽性細胞のサブタイプ間で特徴的に発現がみられた遺伝子について、in situ hybridizationを用いて胎子卵巣組織における発現パターンの解析を行う。この際、Foxl2との二重染色法も行い、正確に細胞群を同定する②今回の一細胞トランスクリプトーム解析の結果ではlncRNAなどの発現も上位に上がってきていることから、他の論文で得られているRNA-Seqデータや、新たに「先進ゲノム支援」により得られた生殖腺におけるRNA-Seqデータ、さらには公共データベースを活用することで、キーファクターとなる遺伝子のさらなる絞り込みを行い、これらについての胎子卵巣組織における発現パターンの解析を行う。③今回得られた遺伝子を転写因子、シグナル伝達、代謝に関わる因子などのグループごとに捉え、発現解析を発生ステージごとに行う。
実験２）胎子卵巣体細胞系譜サブタイプに特徴的な遺伝子の機能検証のためのRISPR/Cas9
によるframe-shift変異マウスの作出と表現型解析：実験1で得られた卵巣体細胞系譜のサブタイプに特異的に発現する遺伝子のうち、特にその特徴を決定づけることが考えられる遺伝子について、CRISPR/Cas9による各遺伝子のframe-shift変異（コード蛋白の機能破壊）マウスを樹立する。これらのマウス系統について、その性決定、生殖腺（卵巣ならびに精巣）での表現型を調べるとともに、成体での生殖機能の確認を行う。この実験については2021年度も含めて計画している。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
新型コロナウイルス感染症拡大に伴い、2020年3月に実施予定であった実験が一部実施できなかったため。次年度以降の発現パターン解析に必要な試薬、実験動物代として使用を計画している。
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