| 研究課題/領域番号 |
19K06443
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| 研究機関 | 日本大学 |
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研究代表者 |
中西 祐輔 日本大学, 生物資源科学部, 助教 (20579411)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 腫瘍免疫 / 好中球 |
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| 研究実績の概要 |
好中球は細菌感染に対する生体防御反応の最前線に位置する重要な免疫細胞である。これまでの研究成果から、ある種のがん細胞株を用いて誘導した腫瘍組織には多量の好中球が浸潤していること、および浸潤している好中球は、NETsと呼ばれる細胞外トラップを放出していることが明らかとなっている。
本研究では、上記の現象がどのようながんの特徴に依存しているかについてと、NETsが腫瘍形成および抗腫瘍活性に及ぼす影響について解析することを目的とした。最初に、好中球を多量に浸潤させうるがん細胞株があるかどうかを検討するため、BALB/cマウス由来のがん細胞株4T1、CT-26、Colon-26を用いて腫瘍を作成し、腫瘍内に浸潤している免疫細胞の同定を試みた。その結果、乳がん細胞株である4T1を用いて誘導した腫瘍内に多量の好中球が浸潤していること、およびそれらの好中球からNETs様の放出物が確認された。先行研究の結果では、大腸がん細胞株CMT-93から同様の結果が得られていたことから、好中球の浸潤誘導はがんが発生した組織に依存するわけではなく、がん細胞の共通した特徴に依存していると考えられた。
次に、大腸がん細胞株CMT-93と乳がん細胞株4T1の共通した特徴を見出すため、遺伝子発現について検討を行った。その結果、顆粒球単球コロニー刺激因子（GM-CSF）の発現が他の細胞株と比較して著しく高い傾向が見られた。そこで、4T1を移植したマウスに抗GM-CSF抗体を投与して、生体のGM-CSFを中和したところ、腫瘍サイズおよび重量の縮小が観察された。その時の腫瘍内の好中球は抗GM-CSF抗体の投与によって低下しており、NETsの形成も抑制される傾向が示された。よって、腫瘍由来のGM-CSFが直接的・間接的に好中球の応答を制御している可能性が示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
当初計画では、NETsが腫瘍に果たす役割について検討するため、NETsの形成に必須の酵素PAD4の遺伝子を欠損させたマウス（Padi4欠損マウス）に、大腸がん細胞株CMT-93細胞株を移植する計画であった。しかし、BALB/cマウス由来の乳がん細胞株である4T1を用いた検討から、より強い好中球の応答が見られたことから、こちらの細胞株を使用してNETsの腫瘍形成に及ぼす影響を解析することのほうが有用と考えられた。従って、遺伝的背景がC57BL/6由来であったPadi4欠損マウスをBALB/cマウス由来に変更している。また、好中球そのものの腫瘍への活性を検討するため、ケモカインレセプターCXCR2アンタゴニストSB225002を投与して、腫瘍内への好中球浸潤を抑制して、腫瘍サイズなどへの影響を評価する計画をしていたが、アンタゴニスト投与が十分な好中球の浸潤抑制を誘導できなかったことから、別の方法を新たに検討する必要がある。以上の理由から、当該研究計画は進行がやや遅れていると判断される。
一方、腫瘍から産生されるNETsの誘導因子の候補としてGM-CSFを同定できたことは、当初の計画よりも早くに達成できた成果である。また、抗GM-CSF抗体の投与によって腫瘍サイズおよび重量の減少、および好中球の浸潤抑制が観察されたことにより、GM-CSFがどのよようにして、好中球の応答を制御するのか、より詳細な解析に取り組むことが可能となった。
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| 今後の研究の推進方策 |
抗GM-CSF抗体の投与によって、好中球の浸潤およびNETsの形成が抑制され、結果、腫瘍サイズの縮小が観察されている。これらの結果は、好中球の産生するNetsが腫瘍の促進に働いていることを示唆している。これらの結果から今後の研究計画は以下の通りとする。
最初に、腫瘍に浸潤している好中球が、腫瘍の促進に働いているのかをより明確にするため、4T1細胞を移植したマウスの好中球の除去を再検討する。既述のようにケモカインアンタゴニストの投与は十分な浸潤抑制効果が見られなかったことから、抗Ly6G抗体の投与等の方法を用いて好中球が腫瘍に果たす役割について明らかにする。
次に、NETs形成が腫瘍に果たす役割を検討するため、Padi4欠損マウスに4T1細胞株を移植し、腫瘍サイズおよび重量の検討を行う。現在、このマウスは遺伝的背景をBALB/cに変える作業をしており、9回程度のバッククロスを予定している。
最後に腫瘍由来のGM-CSFが好中球の応答に直接影響を与えているのか、生体が産生するGM-CSFが好中球の応答に影響を与えているのかを検討するため、4T1細胞株のGM-CSF遺伝子ノックアウト細胞株、およびGM-CSF遺伝子を導入したCT-26細胞株をそれぞれ作成し、マウスに移植する実験を行う。その後、腫瘍に浸潤してくる好中球およびNETsの解析および腫瘍サイズを計測することによって、腫瘍由来のGM-CSFが好中球の応答に与える影響を評価する。以上の検討から、好中球の応答を制御することによるがん免疫治療法の開発を目指す。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
腫瘍中に浸潤している好中球が放出するNetsが抗腫瘍活性のために必須であるのか、また、腫瘍を促進するために放出しているのかを直接的に検討するため、Netsを産生するための必須酵素PAD4の遺伝子を欠損させたマウスを用いて評価する予定であった。しかし、当初予定していた細胞株より、よりこの目的を解析するのにふさわしい細胞株が見つかったことから、この遺伝子欠損マウスの遺伝的背景を変更することを現在おこなっている。従って、この計画に使用する予定であった抗体等の試薬購入がまだ行えていない。遺伝子欠損マウスのバッククロスが終了し次第、必要な試薬を購入する予定である。
また、抗GM-CSF抗体の投与実験において、有益な結果が得られている。引き続き、再現性の確認等で抗GM-CSF抗体が必要となるが、このような生体で使用する抗体は非常に効果でかつ使用量も多いことから、一部の額を次年度に繰り越し、当中和抗体の購入費に使用するため、次年度使用額が生じた。
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