| 研究課題/領域番号 |
19K06454
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| 研究機関 | 千葉大学 |
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研究代表者 |
溝口 貴正 千葉大学, 大学院薬学研究院, 助教 (10645419)
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| 研究分担者 |
高橋 広夫 金沢大学, 薬学系, 准教授 (30454367)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | MIB1 / がん転移 / 異種移植モデル |
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| 研究実績の概要 |
これまでの解析からE3ユビキチンライゲースであるMind bomb1(Mib1)が細胞移動に関与することが明らかとなっている。またMib1発現レベルとがん患者の予後に関連性があることも推察されている。以上のことからMib1ががん転移に関わることが予測された。
そこでMib1の発現とがん転移の関連性を分子レベル度解析するため、ゼブラフィッシュの異種移植モデルを利用したがん細胞転移時の遺伝子発現解析を試みている。まずMib1ががん転移に与える影響を調べるために、doxycycline(dox)依存的にshRNAによりMib1をノックダウンできる乳がん細胞（MDA-MB-231)の作製を試みた。結果doxの添加により、内在性のMIB1を9割ノックダウンできる乳がん細胞株を得た。現在この株を利用し、異種移植の条件検討を行っている。条件が設定でき次第、doxを添加しないコントロールとdox添加によりMib1のノックダウンを誘導した細胞の異種移植を行いMib1発現の有無が転移時の遺伝子発現に与える影響を解析する。また現在の細胞株より、よりMib1ノックダウン効率の良い(100％近いノックダウン効率）細胞株を得るため、shRNA配列を改変した細胞株の作製を試みている。
異種移植に関しては移植場所の検討を行っている。予定していたperivitelline spaceに加え、より移植しやすいyolk sac, 脳室などへの移植を行い、移植できる細胞数や移植後の転移頻度を現在解析中である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
異種移植用のがん細胞として当初はsiRNAによるMib1のノックダウン細胞を用いる予定であったが、実験ごととにノックダウン効率が変わる、移植後にノックダウンを維持できないの恐れがある等の懸念がったため、よりノックダウンの再現性が高いshRNAによるノックダウン系の構築行うこととした。またRNAseq後の解析を踏まえ、より正確な遺伝子発現の変化の検討を行うためdoxycycline(dox)依存的にMib1をノックダウンできる系を採用した。移植後の細胞の増殖、転移を可視化するために緑色蛍光タンパク質（GFP)を恒常的に発現する発現ベクターも同時に使用した。ウィルスを用いてこれらのベクターの導入を行い細胞株を樹立を試み、dox添加により内在性の9割のMib1をノックダウンできる乳がん細胞株（MDA-MB-231由来)を得た。現在よりがん転移頻度を評価しやすい移植条件（移植場所や細胞数）を検討している。またがん細胞移植後のゼブラフィッシュ胚よりtotal RNAを回収し、がん由来のRNAが検出できるか検討した。検討はヒト由来遺伝子に対するqPCRにより行った。結果、移植胚のtotal RNAからヒト由来の転写産物を問題なく検出できることが確かめられた。
条件が設定できればtotal RNAの採取とRNAseq dataの取得へと進む予定であり、おおむね順調に進展している。
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| 今後の研究の推進方策 |
現在、異種移植条件の最適化を進めている。条件が設定でき次第、total RNAの採取とRNAseq dataの取得を行う。また現在用いている細胞株ではノックダウン誘導後、多少Mib1が残ってしまうため、より効率よくMib1のノックダウンが行える細胞株を作製中である。作製後は新規樹立株を用いて解析を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
(理由）実験スケール、手法の見直しにより、各種試薬、プラスチック消耗品の消費が抑えられたため。
(使用計画）保有していない酵素、抗体等の購入に充てる。またRNAseqのサンプル数の拡充に充てる。
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