| 研究課題/領域番号 |
19K06455
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| 研究機関 | 信州大学 |
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研究代表者 |
森 政之 信州大学, 学術研究院医学系, 准教授 (60273190)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | ポルフィリン症 / モデルマウス / 組織障害 / 遺伝子 |
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| 研究実績の概要 |
コプロポルフィリノーゲン酸化酵素（Cpox）遺伝子に活性低下型突然変異をもつマウス系統群を用いて、ポルフィリン症の発症機序の解明を進めた。
NCTマウスの臓器病理の加齢変化、および性差を調査した結果、以下の変化を認めた。雌雄ともに3ヵ月齢で既に心臓における筋肉束間の結合組織の異常増殖。肺の気管支周辺に炎症像。雄のみで真皮下脂肪組織の欠如（前線維化病変）。7ヵ月齢で雄において肝細胞とその細胞核の肥大、および真皮層での線維化。11ヵ月齢で雌においても肝臓に炎症像、雄では肝細胞の肥大、および細胞内における核仁の出現。BALB.NCT-Cpoxnctマウスにおいて皮膚病変出現の加齢変化をより詳細に調査した結果、雌においては14ヵ月齢においても真皮下脂肪組織の消失や線維化は観察されなかった。一方、雄においては3ヶ月齢で一部の個体で既に真皮下脂肪組織の消失と軽度の線維化が観察された。皮膚線維化は加齢とともにやや悪化する傾向が認められたが、12ヶ月齢でも軽度にとどまる個体も散見された。
BALB.NCT-Cpoxnctマウスを用いて、未病気である1ヶ月齢、および病態発症開始期である3ヵ月齢、さらには正常対照であるBALB/cマウスの同月齢での眼球における遺伝子転写産物の種類とその発現レベルをRNA-Seq解析によって解析し、コプロポルフィリンの蓄積によって変化した遺伝子群を抽出した。その結果、小胞体ストレス反応のうち、PKR-like endoplsmic reticulum kinase (PERK)センサーを介した経路が亢進していることが明らかとなった。また、発現差が確認された遺伝子について、オンラインフリーウェアであるQGRS Mapper によりグアニン四重鎖配列の存在を予測した結果、一連のコレステロール合成系遺伝子の有意な集積が検出された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
コプロポルフィリノーゲン酸化酵素（Cpox）遺伝子変異マウスにおけるポルフィリン症の臓器特性、および加齢変化を詳細に明らかとした。また、RNA-Seq解析によってポルフィリン前駆体の蓄積に起因する遺伝子発現プロファイルの変化を明らかとした。一方、それを補完するプロテオーム解析、プロモーターメチル化解析などのエピゲネティック解析については進行が遅れている。
研究計画とは直接関連しないが、研究を進める過程でその副産物としてNCT系マウスに認められる形質である波状被毛（wavy coat）の原因である遺伝子変異を同定することができた。
問題点として、NCT系マウスは妊娠率、および一腹出生仔数が低いなど繁殖性が悪く、かつ仔の成育も悪く、親による食殺も頻発するために、実験に使用できる個体数が制限された。産仔を里親に哺育させることで、離乳前での死亡をある程度回避できるようになった。
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| 今後の研究の推進方策 |
以下の方策により、ポルフィリン中間体による干渉を受ける遺伝子の解明を推進する。細胞バンクからヒト由来培養細胞（NT2（神経系）、Caco-2（消化器系）、SkMC（筋肉）、初代培養細胞（皮膚））を入手する。その培養液にコプロポルフィリンを添加して、上記の実験で発現差が認められたもののヒト相同遺伝子の発現変化をリアルタイムRT-PCR法により検証する。発現差が確認されたマウス／ヒト遺伝子について、WEB上ソフトウェアであるQGRS Mapper によりグアニン四重鎖配列の存在を予測する。マウス、およびヒトのゲノムDNAより、その遺伝子のグアニン四重鎖を含むプロモーター領域をPCR増幅して得る。このDNA断片をルシフェラーゼ遺伝子の上流に連結したレポータープラスミドを構築し、各培養細胞にトランスフェクトする。培地にコプロポルフィリンを添加し、レポーター活性の変化を測定して、コプロポルフィリンによる遺伝子発現干渉効果を確認する。
以下の方策により、ポルフィリン症病態発症に至る機序の解明を推進する。グアニン四重鎖への干渉によって発現が亢進している遺伝子に関しては、shRNA発現レンチウイルス投与によりその亢進を抑制し、病態の軽減効果があることを明らかとする。逆に発現が抑制されている遺伝子に関しては、プロモーターや3’非翻訳領域からグアニン四重鎖を削除した発現コンストラクトによるトランスジェニックマウスを作製して発現補填し、その病態軽減効果を明らかとする。
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