| 研究実績の概要 |
本研究では、ゲノム編集におけるノックイン効率の上昇を目的とし、相同組み換え効率の増幅因子の有効性について検討を行っている。
本年度は、これまでにその効果が示唆される５つの因子(遺伝子A,B,C,D,E)について、マウスES細胞におけるノックイン効率に与える影響について予備検討を行った。この目的のため、マウスES細胞のSox2遺伝子座の3'端に対し蛍光レポーター遺伝子であるVenusをノックインし、融合タンパクとして発現させるようターゲティングベクターを設計、構築した。このベクターと共にSox2遺伝子3'端に対するgRNA及びCas9の発現ベクター、ノックイン効率増幅因子候補の発現ベクターをマウスES細胞に導入した。この結果得られる正しい相同組み換え体では、VenusがSox2遺伝子の核移行シグナルをトラップすることにより、核に局在して発現する。ハイコンテンツイメージアナライザーによる画像解析により、Venusが核に局在して発現するコロニーの割合を定量した。
その結果、遺伝子A,B,C,Dの４因子を同時に導入した際に最もノックイン効率が高かった。一方で、遺伝子Eを加えた場合には効率上昇が認められなかったことから、遺伝子Eはこの系において負の影響を有することが示唆された。一方、遺伝子A,B,C,Dをそれぞれ単独で導入することによって、どの因子においても有意なノックイン効率の上昇効果が認められた。
次に、マウス受精卵におけるノックイン効率上昇効果の検討を進めている。この目的のため、まず、上記の実験から最もノックイン効率上昇効果が高かった遺伝子Aについて、リコンビナントタンパクを作成した。現在導入条件の検討を進めている。
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