RNA干渉による転写依存的な抗体遺伝子の不安定化機構

2020 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 19K06485
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 小林 牧 京都大学, 医学研究科, 特定准教授 (20400690)
• 研究期間 (年度): 2019-04-01 – 2022-03-31
• キーワード: IgH遺伝子 / aicda / germline transcripts

研究実績の概要

抗体産生のために、限られた免疫グロブリン（IgH）遺伝子のS領域で、特にAIDに誘導されたDNA切断が蓄積し、クラススイッチが完了する。その際に、RNAiで介入することによりゲノム不安定性が増加する原因として、germline transcriptsが何らかの領域限定性を与えている可能性を考えた。そこで、今年度は、germline transcriptsのRNA-FISHを行い、germline transcriptsが構造体を形成することを確認した。また、S領域のDNAをラベルする方法をCRISPR/Cas9を応用したSIRIUS系を用いたCAS-FISH（既報）を用いて開発し、RNAのラベルとDNAのラベルが共局在することを確認した。今後、その構造体がDNA切断の領域限定性にどのように貢献するのかを明らかにする必要がある。
また、試験管内モデルとして、S領域の400bpを切り取った塩基配列をプラスミドに挿入したものを作成し、それにT7RNAポリメラーゼを用いて転写を誘導し、RNAiにより二本鎖DNAのnegative, positive supercoilをモニターする系を確立した。テスト段階ながら、RNAiオリゴやRNaseH, Top1などの添加により、このスーパーコイル状態が変化することを検出している。今後、RNAiオリゴがDNAのsupercoil状態にどのような変化を与えるか、明らかにし、試験管内でRNAiが与える効果が細胞内で起きている現象を説明できる可能性を追求する。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

RNAiで介入することによりゲノム不安定性が増加する原因について二つの可能性を考え、各々について有用なモデル系を確立した。

今後の研究の推進方策

germline transcriptsのRNA-FISHにより観察されたgermline transcriptsによる構造体形成とS領域のDNAをラベルしたCAS-FISH（既報）によるRNAのラベルとDNAのラベルの共局在から、その構造体がDNA切断の領域限定性にどのように貢献するのかを明らかにする。germline transcriptに対応するプローブを用いたChIRPにより他の分子の集積を検出する。試験管内モデルが明快な結果を示す場合、原子間力顕微鏡でDNA二本鎖の構造の乱れを検出できるか否かを試みる。

研究成果

• [雑誌論文] RNA-binding motifs of hnRNP K are critical for induction of antibody diversification by activation-induced cytidine deaminase. (2020)
  • 著者名/発表者名: Yin, Z., Maki Kobayashi, Hu, W., Higashi, K., Begum, NA., Kurokawa, K. and Honjo,T.
  • 雑誌名: PNAS USA 巻: 117 ページ: 11624-11635
  • DOI: 10.1073/pnas.1921115117
• [雑誌論文] SAMHD1-mediated dNTP degradation is required for efficient DNA repair during antibody class switch recombination. (2020)
  • 著者名/発表者名: Husain, A., Xu, J., Fujii, H., Nakata, M., Maki Kobayashi, Wang, JY, Rehwinkel, J., Honjo, T. and Begum, NA
  • 雑誌名: The EMBO Journal 巻: 39 ページ: e102931
  • DOI: 10.15252/embj.2019102931