| 研究課題/領域番号 |
19K06493
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| 研究機関 | 東海大学 |
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研究代表者 |
渡邊 孝明 東海大学, 医学部, 講師 (20421365)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | DGCR8 / R-loop / TC-NER / DEAD-boxヘリカーゼ / DNA複製ストレス |
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| 研究実績の概要 |
(a) 紫外線照射によるR-loop蓄積に対するDGCR8の役割: R-loopを除去してDNA切断を生じるTC-NER経路のタンパク質複合体形成を詳細に調べた。ヒト骨肉腫細胞U2OSを用いてゲノム編集により作成したDGCR8-KO細胞とS153Aノックイン細胞を用いた結果、TC-NER複合体のコアとなるRNAPII、CSA、CSBの形成にDGCR8-S153リン酸化が必要である一方、UVSSA、USP7のリクルートには大きな影響がないことがわかった。また、これまでR-loop認識抗体として定評のあるS9.6抗体を用いてきたが、非特異的と思われるシグナルが核外にみられる場合があること、一本鎖および二本鎖RNAを認識する可能性があることから、R-loopに対する免疫染色の方法に改良を加えた。
(b)DGCR8によるR-loop制御へのDEAD-boxヘリカーゼの関与:家族性筋萎縮性側索硬化症４型(ALS4)や眼球運動失行を伴う失調症(AOA2)等に関わり、R-loopを解消するDNA/RNAヘリケースであるSETXとDGCR8の相互作用を調べたが、紫外線照射による変化は見られなかった。
(c)複製ストレスに対するDGCR8の関与: U2OSおよびDGCR8-KO細胞を用いて、DNAファイバー解析を行った結果、正常細胞で紫外線照射による複製阻害が見られるのに対し、意外にもKO細胞で阻害が見られなかった。一方、細胞周期に一度だけ染色体が複製されるよう制御するライセンシング因子Cdt1がTC-NERタンパク質に類似した制御を受けることに着目しているが、DGCR8との相互作用は検出されなかった。
以上のようにDGCR8及びSer153リン酸化が紫外線により蓄積するR-loop除去とそれに伴う複製ストレスに関わることを示す知見が得られた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
当初計画した項目の多くを実施でき、仮説を支持する有意義な結果が得られたため。
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| 今後の研究の推進方策 |
(a)紫外線照射によるR-loop蓄積に対するDGCR8の役割: DGCR8が関わるTC-NER経路はR-loopをDNA二本鎖切断(DSB)に変換し、DNA修復を誘導する。そこでDSBを認識するgamma-H2AXに対する抗体で、U2OS正常細胞、DGCR8-KO細胞、S153Aノックイン細胞におけるDSB形成量を評価する。また癌組織でDGCR8高発現がみられることから、癌遺伝子の発現により蓄積するR-loopの除去に癌細胞がDGCR8を利用している可能性を考えて、癌遺伝子c-Mycの過剰発現とDGCR8変異の関係を調べる。
(b)DGCR8によるR-loop制御へのDEAD-boxヘリカーゼの関与: R-loop制御因子として注目されるDEAD-boxヘリカーゼのうち、DGCR8との相互作用が見られたDHX9、DDX17に対するsiRNAを用いてR-loop蓄積量の変化を定量する。
(c)複製ストレスに対するDGCR8の関与: U2OS正常細胞で紫外線照射によってDNA複製が阻害されたのに対し、DGCR8-KO細胞では阻害が見られなかった結果をうけて、KO細胞で複製阻害に必要なDNA損傷チェックポイントが機能していない可能性、損傷乗り越え複製等が過剰に活性化している可能性を検証する。また、DGCR8変異細胞を用いて、紫外線照射時のR-loop蓄積をChIP-seqで検出し、複製ライセンシング因子Cdt1の分解がDGCR8変異によって影響されるかをWestern blottingで解析する。
以上により新たなR-loop制御の側面、複製ストレスとの明確なリンクを見出すことを目指す。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
コロナ禍において、従来のように情報収集や研究交流を進めることは難しいと判断して学会参加を断念したため、次年度使用額が生じた。また使用計画として、次年度使用額とR3年度予算をあわせ、当初の計画と共に今後の研究の推進方策(c)のChIP-seqによるR-loop検出の対象サンプル数、解析手法を予定より充実させることに充てる。
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