| 研究実績の概要 |
引き続き，IGHV1-69生殖系列遺伝子由来のRF（YES8c，RF-TS1）を中心に研究を行なった。本研究では，試料調製や構造解析を効率的に進めるために，リウマトイド因子の可変領域（VH, VL）のC末端にSARAHドメインを融合したFv-claspを作製して実験を行った。
RF-TS1については L鎖とH鎖の間にジスルフィド結合を導入したFv-clasp(v2)を作製した。RF-TS1 Fv-claspはELISAによりFcに対する結合が確認できたが，両者ともSPRでは結合がほどんど確認できなかった。RF-TS1 Fv-clasp(v0)はFv-clasp(v2)よりも強い結合を示した。RF-TS1 Fv-clasp(v2)について結晶が得られX線回折実験を行ったが，構造決定に十分な分解能のデータは得られなかった。現在，RF-TS1に関して，従来の抗体結合とは異なる抗原結合様式を示すデータが得られつつある。
YES8c Fv-claspについて，リフォールディングにより調製したものと，大腸菌分泌発現により調製したものを比較した。熱安定性などの物性はほとんど同じであった。しかしELISAおよび表面プラスモン共鳴法による結合実験の結果，分泌発現で調製したものがFcに対して高い親和性を有していた。この結果よりL鎖のN末端の相互作用への関連性が示唆された。
RF Fabの大腸菌分泌発現系の確立も試みた。RF-TS1のFabについてN末端付近のコドンの最適化により培養液1リットル当たり0.3mg程度の最終精製物を得た。またYES8c Fabについては培養液1リットルあたり約1 mgの最終精製物を得た。その他，IGHV3－30由来のRFであるRF-SJ1についてFv-claspフォーマットで数mgの精製タンパク質を得ることができた。
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