研究課題
シトクロムP450(P450)はステロイドの生合成等の脂質代謝や薬物代謝において、重要な役割を果たす酵素である。本研究では、P450の酵素反応に必要な還元力を供給するNADPH-シトクロムP450還元酵素(CPR)とP450の複合体の構造決定を行い、CPRからP450への電子移動機構を明らかにすることを目的としている。具体的には天然のCPRとP450の融合タンパク質であるP450BM3に着目し、立体構造決定を目指した。昨年度までに、我々はP450BM3の野生型、P450BM-3の還元酵素ドメイン内のループの一部分を切除した変異体、P450BM3の還元酵素ドメインをCPR-HO複合体で構造解析に成功したドメインに差し替えたキメラ蛋白質についてX線小角散乱測定および多角度光散乱測定を行った。その結果、P450BM3やループ切除変異体は二量体であるが、キメラ蛋白質については単量体であることを確認した。このことは二量体形成に還元酵素ドメインが大きく寄与していることを示している。また、それぞれの概形について情報が得られた。これらの変異体について結晶化スクリーニングを行ったが、現在までのところ良質な結晶は得られていない。近年、有力な構造解析手法の一つとしてクライオ透過電子顕微鏡(TEM)による単粒子解析が用いられるようになった。P450BM3は分子量が単量体で約10万、二量体で約20万とクライオTEMによる解析可能なサイズであることから、P450BM3の野生型について高エネルギー加速器研究機構に導入されているクライオTEMを用いて測定を行った。電子顕微鏡像から想定される粒子径は想定よりも小さく、2次元分類した際の分子の見え方が限られていることなどから、3次元マップを得ることには成功していない。今後、条件の検討が必要と考えられる。
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