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本研究は，細胞内の還元当量による水素合成と共役したプロトン輸送を行う，グループIV[NiFe]ヒドロゲナーゼの反応機構および進化的類縁酵素との共通点や相違点を明らかにすることを目的とする．昨年度までは，対象となる高度好熱菌に対して相同組換えによってゲノムDNAにアフィニティータグを導入する手法を確立し，さらに培養条件と精製条件の検討を重ねることによって，全てのサブユニットが揃った純度の高い精製標品を数mg得られるようになった．今年度からはクライオ電顕による試料の観察を本格的に進めた．まず，様々な界面活性剤の種類やタンパク質濃度の条件でグリッド作製を行い，解析可能な粒子画像の取得を試みたが，推定されるサイズに相当する粒子を確認することはできなかった．また，精製タンパク質を濃縮する際に，ろ液の方に解離したものと考えられるサブユニットが見られたことから，アフィニティータグの位置が不適切であるため複合体が不安定になっている可能性が示唆された．Alphafold2による構造予測の結果，既存の発現系でアフィニティータグを挿入した位置は，鉄硫黄クラスターの形成に干渉している可能性が考えられたため，新たに三種類のタグの位置の異なる標的タンパク質を産生するための遺伝子組換え体の作製を試みた．その結果，三種類のうち一種類のみコロニーが得られ，既存の株と同様の培養・精製によって精製標品が得られた．今後は新しい発現系によって得られたタンパク質試料についてクライオ電顕による観察を行い，複合体の安定性を評価する．
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