| 研究課題/領域番号 |
19K06527
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| 研究機関 | 九州大学 |
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研究代表者 |
高橋 大輔 九州大学, 薬学研究院, 助教 (70791523)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 脂質代謝酵素 / ジアシルグリセロールキナーゼ / 構造解析 / X線小角散乱 |
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| 研究実績の概要 |
脂質の変調が多様な疾患と連関することが明確になってきた．脂質代謝酵素DGKαは，セカンドメッセンジャーとして作用するジアシルグリセロールをホスファチジン酸へとリン酸化し，”がん細胞を増殖させるが，逆にT細胞の活性を減弱する”という生理学的にユニークな働きをもつ．このため，DGKαは，新規がん免疫創薬の標的として近年注目され，阻害剤 のスクリーニングが進められてきた．しかし，細胞膜近傍の疎水的な環境で働くDGKの分子機構の詳細は，不明のままであり，合理的な阻害剤設計に必要なDGKの 立体構造も未決定のままである．本研究では，DGKαの触媒機構と複数の制御領域による分子内活性化制御機構を構造生物学・物理化学・生化学的手法により多角的かつ詳細に解析し，DGKαの構造基盤を明らかにする.本年度は，1. 全長DGKα試料の構造解析，2. N末端制御ドメインの構造・相互作用解析を進めた．
1. DGKα全長試料の結晶化スクリーニングを網羅的に行ったが，ヒットは得られなかった．続いてゲル濾過X線小角散乱測定（SEC-SAXS）による溶液構造解析と，水素/重水素交換質量分析による構造柔軟性の解析を行い，DGKα全長においてカルシウムの非存在下で，構造が大きく変化する領域がN末端のEF-handであることを明らかにした．
2. N末端制御ドメインRVH-EFドメインのX線小角散乱測定, 2次元NMR測定を行い，Ca2+結合によるEF領域の構造変化を更に特徴づけた．カルシウムの存在下ではEF-hand，RVHが各々独立した構造を保持しているのに対し，カルシウム非存在化では，アポ型のEF-handが伸長した構造をとり，RVHと相互作用することが示唆された．さらにもう一つの制御領域C1ドメインの試料を調製し，RVH-EFとの相互作用を解析したが，直接的な相互作用は見られなかった．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
結晶化に必要な全長DGKα試料を大量調製し，結晶化スクリーニングを進めたが，結晶を得るのに難航している点が，やや遅れている原因である．一方，N末端制御領域の溶液構造解析，相互作用解析は，ゲル濾過クロマトグラフィー光散乱，X線小角散乱（SEC-MALS, SEC-SAXS），重水素交換質量分析を用いて進めることができた．
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| 今後の研究の推進方策 |
DGKα全長と新規に調製したDGKαC1-CD領域の結晶化スクリーニングを進める一方で，結晶が得られなかった場合の対策として，クライオ電子顕微鏡単粒子解析による構造解析を試みる．DGKα全長試料３種（Hisx6-DGKα, Hisx6-eGFP-DGKα, Hisx6-DGKα-eGFP）を既に調製しており，DGKα全長単体および抗GFP抗体Fabとの複合体の解析を行う．
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