| 研究課題/領域番号 |
19K06540
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| 研究機関 | 三重大学 |
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研究代表者 |
湊元 幹太 三重大学, 工学研究科, 准教授 (80362359)
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| 研究分担者 |
瀧口 金吾 名古屋大学, 理学研究科, 講師 (20262842)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 人工細胞 / リポソーム / 細胞骨格 / GUV / 細胞モデル / 脂質二分子膜 / バキュロウイルス / マイクロコンパートメント |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、細胞接着分子と細胞骨格、および情報伝達系などを、組換え技術で再構成した巨大リポソーム（Giant Unilamellar Vesicles; GUVs）ベースの人工細胞モデルが、細胞-細胞間の結合を模倣することでネットワークが再構成され、それにより秩序構造と共役挙動が発現する組織体となるのか、ということに取り組んでいる。既に実施していた科研費研究課題（基盤研究(C) 16K07293「人工細胞システムによる細胞情報クロストークの実現と細胞動態解析」）を発展させることも狙っている。
今年度は、まず、私たちが既に開発してきている、１）細胞サイズの脂質2分子膜ベシクル（GUVs）の大量調製技術（逆相遠心法 Reverse-Phase/Centrifugation Method）と、２）バキュロウイルス出芽粒子（BV）による組換え膜タンパク質再構成技術を用いて、大量のGUVへの膜タンパク質導入条件を検討し、共焦点顕微鏡観察下、直径20µm程度のGUVが集積したところへBVが膜融合する適切な脂質組成を見出した。
並行して、GUVと細胞骨格（アクチン）のシンプルな系での協働的な相互作用のモデル実験も展開した。
また、細胞骨格と細胞接着分子を連絡する分子であるFERMドメインを持ったERMファミリーに属するタンパク質の再構成を行うため、組換えウイルスを作り感染宿主細胞（Sf9細胞）で発現した目的タンパク質の解析を進め、当該ドメイン欠損と細胞内局在の影響、およびBV取込特性への影響を、認めており現在さらに検討中である。
さらに、上述課題とも関係して、機能性BVについて良い保存条件を得る検討の過程で、保存剤トレハロースが示す凍結融解の繰り返し操作におけるダメージ軽減の有効性を確かめている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
１）直径20マイクロメートル程度の細胞サイズの脂質2分子膜ベシクル（GUVs）を私たちで開発した逆相遠心法（Reverse-Phase/Centrifugation Method）を使って容易に高密度に密集させることが可能なGUVを、単成分～多成分に亘り比較的広いリン脂質組成の選択、並びに、生理的緩衝液を含む種々の水溶液の選択が、可能となっている。適切に選ぶことで、これらのGUVへ50％を超える割合で組換え膜タンパク質を提示することができるBVを膜融合させることが可能となり、現在進行している試験を踏まえると、その融合率はさらに高められると考えている。
２）既に私たちが示してきている膜貫通型のタンパク質に加えて、膜や受容体に細胞質側から接し細胞骨格との連絡を担うタンパク質についても、組換えバキュロウイルスによる取り込みが行われることを見出し、さらに、人工膜を用いた実験にも取り掛かれている。
３）前記研究課題に引き続き、本課題でも、支持膜である球状人工細胞膜を用いた膜受容体タンパク質の提示を特異的な抗体結合等により、以前以上に精度よく検討しほぼ条件を見定めつつある。GUVの利用を補完することも可能な方法として期待できる。
１）～３）は、当初計画から見てよく進展しているところもあり、集積に十分なGUVは得られているが、一方、集積の制御についての条件検討の部分の進展は若干遅れていることから（３）と判断し、R2年度以降さらに推し進めることを図りたい。
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| 今後の研究の推進方策 |
引き続き、１）細胞サイズ（10～20 マイクロメートル）のリン脂質二分子膜ベシクル（Giant Unilamellar Vesicles; GUVs）の大量調製技術、２）組換えバキュロウイルスによる膜タンパク質再構成技術、そしてさらに３）細胞骨格再構成の技術を含めて、細胞結合ネットワークモデルの形成に取り組んで行く。広い脂質条件と溶液条件で既に大量調製が可能となっていることから、タンパク質性、非タンパク質性、の何れも取り込んでいくことによる、GUVの集積と、GUV接着界面またはその内外水相における導入タンパク質（受容体、骨格等）等の機能発現を図っていく。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
「現在までの進捗状況」に述べたように若干の進展が遅れていることから次年度の繰り越しが生じている。但し、研究期間全体を通しての進捗には問題が無く、次年度以降、細胞結合ネットワークモデルを構築するうえで重要な人工細胞GUVの集積の制御研究において必要となる物品費等に充当していく。
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