| 研究課題/領域番号 |
19K06544
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| 研究機関 | 熊本大学 |
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研究代表者 |
坂本 泰久 熊本大学, 大学院生命科学研究部(医), 助教 (20613392)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | ユビキチン化 / インテグリン / スプライスバリアント |
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| 研究実績の概要 |
がん細胞の異常な増殖、生存、運動はがん悪性化の原因となる。これには細胞接着分子インテグリンの膜表面での活性化が関与する。本研究は、インテグリンα5β1の下方抑制を制御するユビキチン化酵素Nedd4Lの働きと、その破綻によるがん悪性化の仕組みを解明する。
1，2年目の研究成果によって、インテグリンα5β1又はEGF受容体を刺激するとNedd4Lの活性化の指標となる自己ユビキチン化が見られることを見出した。その活性化機構として、Nedd4Lのリン酸化による制御に着目し、質量分析によって活性化に重要なリン酸化部位を同定した。
データベースによるとNedd4LのSplice variantは複数存在するが、一部のSplice variantでは我々が同定したリン酸化部位を欠損している。このことから、Nedd4Lにはリン酸化によって活性化するVariantとリン酸化制御を受けないVariantが存在することになる。異なる制御機構を持つVariantの発現ががん悪性化に関与する可能性がある。そこで、本年度は各種Variantを特異的に認識する抗体を作製に取り掛かった。抗体ができ次第、腫瘍におけるNedd4L variantの発現解析を計画している。さらにNedd4L Splice variantの組み換えタンパク質を精製し、Nedd4Lの自己ユビキチン化を指標としたアッセイを構築した。その結果、Nedd4L Variant毎に異なる活性化機構を持つことを明らかにした。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
Nedd4L variantを特異的に認識する抗体の作製に時間がかかっており、腫瘍における発現解析が進んでいない。
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| 今後の研究の推進方策 |
Nedd4L Splice variantを抗体で検出する方法を計画しているが、RT-qPCR、さらにはSplice variantの解析に適したLong readのRNA-seqを利用することも検討している。これらの手法によって腫瘍またはがん細胞株におけるNedd4L Variantの発現を評価する。Variantのがん悪性化への影響を調べるため、Nedd4Lのノックアウト後に、異なるVariantの発現実験を計画している。
Nedd4L Splice variantの組み換えタンパク質を用いたユビキチン化アッセイでは、variantによって異なる活性化機構を持つことを明らかにしている。腫瘍またはがん細胞株においてNedd4L variantの発現差が見られない場合は、Variant毎の活性化機構の違いをテーマとして研究をまとめる予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
新型コロナウイルスの感染防止のため、予定していた出張が中止になり予算を使用しなかった。さらに、抗体作製が年度をまたいでしまい、次年度支払いが必要となった。また、年度内予算には論文掲載料を見込んでいたが、掲載に至っておらず次年度予算によって支払う予定である。
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