| 研究課題/領域番号 |
19K06551
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| 研究機関 | 関西大学 |
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研究代表者 |
山中 一也 関西大学, 化学生命工学部, 准教授 (30756870)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | D-アミノ酸 / D-ペプチド / プロテアーゼ / 新規酵素 |
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| 研究実績の概要 |
初年度の研究において、放線菌Streptoalloteicus hindastanusに見出した長鎖D-ペプチド分解活性が、細胞表層に局在するβ-ラクタマーゼ様の新規酵素の触媒作用によるものであることを明らかにしている。そこで、昨年度はこの組み換えD-ペプチド分解酵素(Dpd)を用いたin vitroでの詳細な機能解析を行い、当該新規酵素の酵素化学的諸性質の全容解明を目指した。
初年度研究の過程で、Dpdは、大腸菌を宿主として異種発現させると、その大部分は不溶性封入体となるものの、僅かながら可溶性タンパク質として得られることが分かっていた。そこで当該酵素の由来菌の培養液上清から分離精製したD-Dabのホモポリマーを基質としてin vitroでの分解活性評価に着手した。しかしながら、当該組み換えDpdの活性は極めて微弱であり、また精製後まもなく失活するという物理的な不安定性を抱えていることが判明し、残念ながら十分な機能解析を行うことが困難であった。そのため、昨年度は可溶性発現を促進するマルトース結合タンパク質タグとの融合発現や、ブレビバチルスを宿主とした分泌発現など、あらゆる汎用発現系を用いて組み換えDpdの再構築を試みたが、何れにおいても活性型の組み換え酵素を得ることはできなかった。その一方で、異種放線菌を宿主とした独自の誘導発現系においては、誘導剤濃度依存的に発現レベルを制御しながらDpdを発現させることに成功した。また、これと並行してDpdのホモログ酵素であれば活性を安定に保持した状態で異種発現できる可能性を考え、微生物ゲノムデータベース上から見出したDpdホモログの組み換え酵素構築も行った。期待した通り、このホモログ酵素は大腸菌宿主において機能的組み換え酵素として発現可能であり、実際にin vitroでD-Dabホモポリマーの分解活性を示すことも確認できた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
研究の初年度に構築したDpd組み換え酵素は、難可溶性発現であり更に物理的な不安定性を抱えていたため、残念ながら計画していたin vitro機能解析を行うことが困難であった。これに加えて2020年度はコロナ禍で研究室を閉鎖せざるを得ない期間もあり、組み換え酵素発現系の再構築には一定の時間を要したが、最終的に放線菌を宿主とした独自の発現系を用いることで機能的な組み換えDpdを得ることに成功した。また、そのホモログ酵素についても組み換えタンパクとして調製することにも成功しており、これらの比較解析にも道を切り開くことができたと考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
研究計画に若干の遅れが生じたが、機能的なDpd組み換え酵素発現系構築することができたことから、2021年度は組み換え酵素を用いたin vitro機能解析を通して基質特異性や反応速度論解析を含む当該酵素の酵素学的諸性質の全容解明を目指す。基質特異性評価においては、D-Dabホモポリマーやε-ポリリジン等のイソペプチド構造の天然ホモポリアミノ酸だけでなく、各種化学合成D-アミノ酸含有ペプチド基質に対しても同様に評価を行う。
また、一次構造の類似性が高い酵素との構造機能相関の比較解析は、触媒残基や基質認識に関与するアミノ酸残基及び反応機構推定にも重要な知見を与えると期待できる。既にDpdホモログ酵素についても組み換え発現系を構築できていることから、今年度は、この新たに見出したホモログ酵素についても酵素学的諸性質を明らかにし、それらの構造機能相関から触媒残基及び基質認識に関与するアミノ酸残基を推定、更に部位特異的的変異を導入することにより同定を目指す。これにより基質アミノ酸残基立体認識機構に関する知見を得ると共に、その知見に基づいた基質特異性改変にも挑戦する。
また、組み換えDpd及びそのホモログ酵素、更には一連の研究過程で作出するそれらの変異型酵素の逆反応を利用した各種非天然型生理活性D-ペプチドの酵素合成への応用の可能性も探る。
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