| 研究課題/領域番号 |
19K06553
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| 研究機関 | 公益財団法人がん研究会 |
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研究代表者 |
芳賀 淑美 公益財団法人がん研究会, がんプレシジョン医療研究センター がんオーダーメイド医療開発プロジェクト, 研究員 (40525789)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 糖鎖 / 質量分析 / グライコプロテオミクス |
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| 研究実績の概要 |
O-GlcNAc修飾は細胞内タンパク質の機能をダイナミックに調節することが知られている。特に癌ではO-GlcNAc化の昂進が高頻度に見られ、リン酸化と共に癌細胞の増殖、浸潤、転移などに関与するという報告もある。しかし、これまでO-GlcNAc修飾の変化を付加部位ごとに、高感度に、かつ網羅的に調べる技術は存在せず、O-GlcNAc修飾が持つ生理機能はごく限られた断片的な知見しか得られていない。そこで本研究では、微量の生体試料中のO-GlcNAc修飾部位を網羅的にプロファイル解析する技術の開発を目指している。
令和元年度は、HCT116細胞総抽出液を用いて新規O型糖タンパク質プロファイル法の核となるβ脱離反応、糖鎖付加部位のラベル化反応の条件決定を行い、本法用にLC-MS分析パラメータを至適化した。特にビオチンラベル化後のペプチド精製、およびストレプトアビジンビーズを用いたラベル化ペプチドの濃縮ステップの改善を入念に検討した。O型糖鎖修飾ペプチドの濃縮を行い、LTQ-Orbitrap-Fusion Lumos質量分析計(ThermoFisher Scientific社)にて分析を行った。さらに年度の途中で質量分析器に新規に導入されたイオンモビリティインターフェース(FAIMS)の測定条件最適化を行い、培養細胞抽出液中のO型糖鎖付加部位の同定数を最大化する条件を検討中である。その後取得した質量分析データをプロテオミクス包括的解析ソフトウェアProteome Discoverer 2.4を用いて解析し、O型糖鎖付加部位の同定を行った。その結果、現在までに2791か所のO型糖鎖付加部位が同定された。さらに、得られた結果のGO解析、パスウェイ解析を行った。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
ターゲットであるO型糖鎖修飾糖ペプチドを非常に高い効率で濃縮することに成功した。トリプシン消化物をそのまま質量分析計で測定した場合、O型糖鎖修飾のある糖ペプチドは全ペプチドの0.4%しか存在が確認できなかったが、本法を用いることにより、サンプル中の含有率が79%まで上昇した。これにより、計画当初目標としていたO型糖鎖付加サイト2000か所同定の目標をすでに大幅に上回る2791か所ものO型糖鎖付加部位を同定することに成功した。生体サンプル内で存在量の少ないO型糖タンパク質を網羅的に捕捉する新規技術の確立に向けて順調に進展している。実験が順調に進捗していることから、予定を早め、GO解析、およびパスウェイ解析を行った。GO解析の結果から、核、細胞質、膜、ミトコンドリア等幅広い分布のタンパク質が同定できており、本法がバイヤスのかからない優れた方法であることが明らかになった。
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| 今後の研究の推進方策 |
培養細胞総抽出液を用いた実験において、すでに多数のO型糖鎖付加部位が同定されているが、さらなる高感度化を目指し、条件の至適化を行う。具体的には、本年度途中導入したイオンモビリティインターフェース(FAIMS)の測定条件最適化を重点的に行う。これまでの実験結果より、本法用に調製したO-GlcNAc修飾ペプチドは通常のトリプシン消化ペプチドとイオンモビリティー測定条件における挙動が大幅に異なることが明らかになっている。ペプチドの分画法の検討と合わせ、慎重に検討する。さらに、癌細胞株を用いたO-GlcNAc化タンパク質の網羅的解析による癌特異的O-GlcNAc化基質の同定と機能解析を実施する。細胞株にOGT発現ベクターまたは空ベクター(mock)を導入し、特異的に増加するO-GlcNAcタンパク質、またはO-GlcNAc化される部位の同定を行い、OGTの新規基質を同定する。
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