| 研究課題/領域番号 |
19K06555
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| 研究機関 | 国立研究開発法人産業技術総合研究所 |
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研究代表者 |
横田 亜紀子 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 主任研究員 (20415764)
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| 研究分担者 |
野田 尚宏 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 研究グループ長 (70415727)
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| 研究期間 (年度) |
2020-02-01 – 2023-03-31
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| キーワード | w/oエマルション / 変異ライブラリ |
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| 研究実績の概要 |
本研究においては、変異ライブラリと、w/oエマルションを利用したスクリーニング系を組み合わせ、目的機能を有する有用タンパク質を迅速かつ簡便に探索する新しい手法の構築を目指す。今年度は、昨年度に引き続き、選択したターゲット分子の変異ライブラリの調製、遺伝子組換え大腸菌のw/oエマルションへの封入、などに取り組んだ。
まずは、機能変換や安定性向上などの点から研究対象に適していると判断した配列特異的エンドリボヌクレアーゼMazFについて、変異ライブラリの構築に取り組んだ。昨年度は失敗に終わったランダム変異導入であるが、今年度は新しい別の変異導入用キットの使用や、PCR条件の再検討などを経て、多数の変異クローンの取得に成功した。今後、取得したクローンについて、無細胞発現系などを用いた迅速なタンパク発現と機能評価を試みたいと考える。
また、上記MazFのスクリーニングの予備実験として、機能評価や変異効果の検出が比較的容易と考えられる蛍光タンパク質を用いてのスクリーニングのモデル系の構築を試みた。今年度は、昨年度とは蛍光波長が異なる蛍光タンパクを発現する組換え大腸菌を新たに作製し、2種類の（2色の）大腸菌をそれぞれw/oエマルションに封入・培養し、それらが発する蛍光の色の違いによるw/oエマルションのソーティングが可能かどうかを検証する予定であった。しかしながら、光るはずの組換え大腸菌が全く光らない、という想定外の事態が発生し、実験が著しく滞ってしまった。発現ベクターの設計と作製を繰り返し、宿主大腸菌の種類を変更するなど試行錯誤の結果、ようやく当初想定していた蛍光を発する菌体の取得に成功した。来年度は、異なる蛍光を発する2種類の組換え大腸菌を封入したw/oエマルションについて、その蛍光の違いによるソーティングなどに取り組む予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
昨年度に引き続き、コロナ禍による出勤制限や、自宅待機が続き、実験が進まなかったことが挙げられる。その他の理由としては、研究実績の概要に記載した通り、光るはずの遺伝子組換え大腸菌が全く光らない、という想定外の事態が発生し、実験が滞ってしまったことも挙げられる。それゆえ、今年度の当初の予定であった目的分子の効率的な取得方法の検討や、作製した変異導入クローンの効率的なコンパートメント化については、今後の課題としたい。
その一方で、変異ライブラリの構築に関しては順調に進んでおり、来年度以降の研究の進展が期待できると考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
変異導入クローンの取得に成功したことから、次の段階として、今年度は着手できなかった、作製した変異導入クローンの効率的なコンパートメント化などに取り組む予定である。また、異なる蛍光タンパク質を発現する遺伝子組換え大腸菌の作製にも成功したことから、蛍光の波長や強度の違い等によるw/oエマルションを用いたスクリーニングにも着手し、モデル系でのシステム構築を進めていきたいと考える。
なお、今年度もコロナ禍のため、業務時間の確保が難しく研究の進捗に影響が出たことから、その遅れを取り戻すべく、来年度も補助員の雇用なども視野に入れ、研究のスピードアップを図っていく予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
今年度もコロナ禍で出勤制限が続いたこともあり、研究が滞りがちであったこと、デスクワーク（テレワーク）が多くなり実験器具・試薬の購入が少なかったこと、また、当初予定していた学会への参加を見合わせたため、それに係る参加費や旅費が発生しなかったこと、などの理由から、次年度使用額が生じた。次年度の使用計画としては、昨年度に引き続き、人件費を充実させ、補助員を雇用して研究のスピードアップを図り、進捗の遅れを取り戻したいと考えている。
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