| 研究課題/領域番号 |
19K06558
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| 研究機関 | 東北大学 |
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研究代表者 |
二井 勇人 東北大学, 農学研究科, 准教授 (90447459)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 膜内切断プロテアーゼ / 認知症 / 酵母 / 酵素 / 脳・神経 |
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| 研究実績の概要 |
膜内切断プロテアーゼは、膜内で加水分解を行う特殊なタンパク分解酵素で、どのようにして反応を遂行するのかについて、よく分かっていない。本研究では、モデル生物である出芽酵母に切断反応を再構成した独創的な解析手法をとり入れ、アルツハイマー病の原因となるアミロイドβ（Aβ）を作り出すγセクレターゼ複合体とそのモデルとなる単量体膜内切断プロテアーゼによる分解のメカニズムを明らかにすることを目的とした。
令和元年度においては、γセクレターゼについての研究では、１）γセクレターゼの基質であるアミロイド前駆体（APP）の変異体をスクリーニングし、解析した。家族性アルツハイマー病（FAD）のAPP変異では切断効率が低下する一方、切断を回復させる変異を同定することに成功した。２）アルツハイマー病リスク因子として知られる小胞輸送関連因子について、酵母ホモログ遺伝子の破壊株を用い、γセクレターゼ活性への影響を解析した。
PICALM、CD2AP、BIN1のホモログ遺伝子破壊により切断活性が低下し、多胞エンドソームの形成に関わるESCRTの遺伝子破壊によっても切断活性が低下した。３）γセクレターゼの調節サブユニットであるAph1からプロテアーゼ活性を上昇させる活性化変異を同定し、マウス胎児線維芽細胞 (Aph1TKO MEF)に導入して解析した。Aβ生成量を増加させ、Aβトリミングを促進させる効果を持つことを解明した。
一方、単量体膜内切断プロテアーゼについての研究では、ヒトSite-2プロテアーゼ（S2P）とヒトロンボイド （RHBDD1）による基質切断の再構成を試みた。S2P基質であるSREBPとATF6、RHBDD1基質となるSpitzを用いたが、S2Pによる転写因子SREBPの切断を検出することに成功した。他の組み合わせでは、内在性プロテアーゼによる切断などが障害となり、再構成できなかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
実施を予定していた（I）γセクレターゼ活性調節機構の解明、（II）膜内切断プロテアーゼの基質導入機構の解明について、それぞれについて達成度を自己評価する。
(I）酵母γセクレターゼ発現系を用いたスクリーニングで、基質であるアミロイド前駆体から切断感受性を上げる変異体を発見し、切断感受性低下するFAD変異と逆の作用を持つ変異を同定したことは意義深い。また、アルツハイマー病のリスク因子をはじめ、小胞輸送の改変によりγセクレターゼの活性が調節されることが明らかとなった。γセクレターゼの制御サブユニットAph1の活性化変異体のマウス胎児線維芽細胞 (Aph1TKO MEF)での解析は実施年度を前倒しして行い、哺乳類細胞中での活性を確認する成果を得た。
(II)ロンボイドRHBDD1とSite-2プロテアーゼ（S2P）の活性評価系の構築を試みた。S2Pの活性評価系の構築には達成したが、基質によってはきれないものがあるなど課題があった。RHBDD1の再構成でも異なる基質を試みるなど今後、最適化する必要がある。
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| 今後の研究の推進方策 |
当初の予定通り、γセクレターゼと単量体膜内切断プロテアーゼの機能を解析する研究を進める。１年目にAPPのFAD変異体の切断を回復させる切断感受性変異体を同定することに成功して、APP変異体を解析する展望が開けた。γセクレターゼによる基質切断部位の配列特異性は低く、基質特異性についてはわかっていないことが多い。基質側に切断感受性を変化させる変異体が取得できたのは、予想外の成果である。切断されやすい膜貫通ヘリックスと切断されない膜貫通ヘリックスについて、何が異なるのかを知ることは、γセクレターゼの活性制御において、重要な知見となるため、２年目以降も基質認識部位を明らかにする解析を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
実験計画は概ね計画通り進んだが、酵母を用いた再構成系の一部が構築できず、予定していた幾つかの支出について行わず、次年度使用額が生じた。令和２年度において、酵母を用いた再構成実験に使用する。
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