| 研究課題/領域番号 |
19K06561
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| 研究機関 | 名古屋大学 |
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研究代表者 |
小原 圭介 名古屋大学, 理学研究科, 助教 (30419858)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 細胞膜 / 脂質非対称 / 真菌感染症 / 酵母 / シグナル伝達 / センサー / ユビキチン化 |
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| 研究実績の概要 |
細胞膜の脂質二重層では、その内外層で脂質分子が偏って分布している。その様な脂質非対称の維持や適切な調節は細胞の生存に必須である。本研究では、脂質非対称の乱れを感知して、Rim101経路を介して適応反応を引き起こす脂質非対称センサータンパク質Rim21に注目し、その脂質非対称感知機構とシグナル伝達の様子を明らかにすることを目的としている。
今年度は、脂質非対称センサーモチーフを含んでいるRim21のC末端細胞質領域（Rim21C）の組換えタンパク質の精製を試みた。また、Rim21Cに結合し、シグナルを伝達するアレスチン様のRim8についても組換えタンパク質の精製を試みた。
また、Rim21が活性化して下流因子にシグナルを伝達する際には、ユビキチンリガーゼRsp5によるユビキチン化が必要であることが示唆されている。そこで、Rsp5によるRim21のユビキチン化をin vitroで検証するために、Rsp5およびE2酵素であるUbc4の組換えタンパク質を調整した。ユビキチン化によるシグナル伝達の活性化は、しばしば脱ユビキチン化による不活性化と拮抗している。そこで、脱ユビキチン化酵素をコードする遺伝子の欠損株やそれらの二重欠損株を作製し、Rim101経路の活性化をモニターした。すると、ある脱ユビキチン化酵素遺伝子の欠損株でRim101経路が恒常的に活性化していることを見出した。ユビキチン化と脱ユビキチン化の拮抗作用によるRim101経路の活性調節機構が浮き彫りになった。Rim101経路の活性化は病原性真菌が宿主内で増殖し病原性を発揮するのに必須である。その調節機構の一端を明らかにしたことは、真菌感染症の創薬に繋がる大きな一歩である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
Rim21Cによる脂質非対称変化の感知機構について、組換えタンパク質の作製、精製を試みている。しかし、大腸菌での発現が十分ではなく、in vitro実験系に用いるのに十分な量が確保できていない。そこで、昆虫細胞を用いた精製系の構築を始めたところである。一方、ユビキチンリガーゼRsp5やE2酵素Ubc4に関しては、十分量の組換えタンパク質の調整に成功した。したがって、脂質非対称感知機構の解明に向けたin vitro系の構築に関しては、困難に直面しながらも少しずつ進展している。
Rim21が発するシグナルの伝達機構に関しては大きな進展があった。シグナル伝達をRsp5によるユビキチン化が正に制御することは報告されていたが、本研究で脱ユビキチン化酵素が拮抗的に作用し、Rim101経路の活性化を調節することを発見した。Rim101経路の活性化は、病原性真菌類の宿主内での増殖と病原性に必要である。この発見により、脱ユビキチン化酵素を活性化する化合物の探索を通した真菌感染症の創薬という新しいアプローチに道が拓かれた。また、Rim101経路の活性化が終結する仕組みの解明にも取り組み始めた。そのために切断されて活性化した内生のRim101を検出する抗体を作製し、その精製に成功した。
この様に、部分的には思った様な進展がみられなかった側面もあるが、予想外の発見や進展を見せた部分も有り、総合的に判断するとおおむね順調に進展していると判断できる。
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| 今後の研究の推進方策 |
引き続きRim21による脂質非対称感知機構の解明に取り組む。Rim21Cの組換えタンパク質の大量精製が必須であるため、昆虫細胞を用いた発現系の構築を急ぎたい。また、Rim21からシグナルを直接受け取ると考えられるRim8などの組換えタンパク質の調整も試みる。それらの組換えタンパク質に加えて、調整済のユビキチンリガーゼRsp5、E2酵素Ubc4などの組換えタンパク質も用いて、脂質非対称の感知からシグナルの出力までの分子機構に迫りたい。
また、私達はRim21CにGFPを融合することで、生きた酵母細胞で脂質非対称の状態をモニターできる脂質非対称バイオセンサーを開発できることを示唆してきた。予備的な実験で、Rim21Cに系統的な点変異を導入することで、プロトタイプに比べてS/N比が大きく向上した改良版を作製することに成功した。脂質非対称バイオセンサーの開発は本研究で期待される波及効果の一つであるため、これも進めたい。また、その点変異を導入したRim21Cの組換えタンパク質を作製することで、脂質非対称感知機構の解明にも還元的にメリットがあるため、相乗効果が期待できる。
Rim101経路の活性化調節機構の解明は、真菌感染症の創薬に新たな道を拓く可能性がある。そこで、今年度までに明らかにしてきた脱ユビキチン化によるRim101経路の抑制機構やRim101経路の活性化終結機構についてもさらに研究を深化していく予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
令和元年度は、主に消耗品の購入・使用に関して、当初想定していたよりも効率的に運用することができ、物品費の大幅な節約が出来た。また、年度末に参加を予定していたシンポジウム等が新型コロナウイルス（COVID-19）の感染防止の目的で開催中止になった。そのため、旅費や参加費の使用額が減少した。さらに年度末には、オンライン講義の準備など、研究計画時には想定していなかった事柄に時間をとられた。比較的高額な消耗品を用いる実験を幾つか計画していたが、その様な事情から次年度に持ち越すことにした。持ち越した実験計画を含め、次年度には当初の計画を達成すべく研究を推進する予定である。そのための物品費や学会参加旅費・参加費などに研究費を用いる予定である。また、論文の投稿などに至った場合には、英文校閲費、投稿費などに用いる。
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