研究課題
エンドサイトーシスは細胞外の物質を細胞内へと取り込む機構であり、栄養物質の摂取、免疫応答機構などの基本的生命現象に関わっているほか、細胞の癌化や病原ウィルスの感染等、ヒトの病気とも深く関わっている。また、エンドサイトーシスは、リガンドとの結合により活性化された細胞膜上受容体を不活性化する過程においても重要な役割を果たしている。この過程において、活性化した受容体はまずエンドサイトーシスにより細胞内に取込まれ、初期エンドソームへと輸送される。初期エンドソームに輸送された受容体はリガンドと解離し、リサイクリング経路により細胞膜へと戻される。一方、受容体から解離したリガンド、および受容体の一部は、後期エンドソームを経てリソソームへと輸送され、分解される。このエンドサイトーシスによる受容体の分解・リサイクリング機構は、出芽酵母から哺乳類細胞に至る全ての真核細胞で広く保存されており、様々な細胞外シグナルの活性制御において重要な役割を果たしている。本研究の目的は、Gタンパク質共役型受容体をはじめとする受容体のエンドサイトーシスによる受容体の分解・リサイクリングの分子機構を明らかにすることである。これらの目的について、本年度、（研究課題①）GPCRがクラスリン小胞に取り込まれる分子機構の解明、（課題②）GPCRのクラスリン小胞から初期エンドソームへの輸送機構の解明、（課題③）GPCRの初期エンドソームでのリサイクリング機構の解明、および（課題④）GPCRの初期－後期エンドソームへ輸送におけるRabタンパクの機能解析、の４つの研究課題について研究を実施した。今年度はコロナウイルスの影響で、2ヶ月間完全に研究が中断されたほか、研究時間もかなり制限されたため、課題①課題③に関しては当初の予定通りには遂行することができなかったが、課題②と課題④に関しては概ね計画通りに進めることができた。
3: やや遅れている
本年度研究計画に沿って以下の研究を実施した。まず、「課題①GPCRがクラスリン小胞に取り込まれる分子機構の解明」については、これまでに細胞膜成分の１つであるPI(4)Pが重要な役割を果たしていることを明らかにしている。今回、私は細胞膜と小胞体の接触部位におけるPI(4)Pの輸送について解析を行った。細胞膜-小胞体接触部位の形成に異常がある変異体を作成し、PI(4)Pの細胞膜量を調べた結果、著しく上昇していることが分かり、さらにこの細胞ではGPCRのクラスリン小胞への取り込みに欠陥があることを見出した。「課題②GPCRのクラスリン小胞から初期エンドソームへの輸送機構の解明」については、昨年度に引き続きエンドサイトーシス小胞と初期エンドソーム間の融合に重要な働きをしているアクチン細胞骨格について、哺乳類Eps15ホモログであるPan1pをプローブとしたラパマイシン誘導性二量体化法を用いて、クラスリン小胞とアクチンの結合を仲介する分子の同定を試みた。この結果、Pan1p結合タンパク質であるSla2(哺乳類Hip1Rホモログ）とEnt1(哺乳類Epsinホモログ）がPan1pと協調してはたらいていることを明らかにした。「課題③GPCRの初期エンドソームでのリサイクリング機構の解明」については、GPCRのリサイクリングにおいてゴルジ体内の特定区画が重要な役割を果たしていることを明らかにした。また、ゴルジ体膜上の特定の脂質（PS）量の調節が重要であることを明らかにした。「課題④GPCRの初期－後期エンドソームへ輸送におけるRabタンパクの機能解析」については、GPCRの初期－後期エンドソーム間輸送に関わるRab5 GTPaseについて、その活性化に必要な新しいゴルジ体局在タンパク質を同定することに成功した。
課題①については、これまでにGPCRの細胞内への取り込みには細胞膜上でのPI(4)Pのリン酸化、および小胞体膜と細胞膜間の相互作用によるPI(4)P代謝が重要であることを明らかにした。今後は、細胞膜-小胞体接触部位におけるPI(4)Pのキナーゼおよびホスファターゼの局在、およびそれらの活性制御機構について明らかにする。課題②については、本年度に引き続きラパマイシン誘導性二量体化法を用いて、クラスリン小胞とアクチンの結合の分子機構を調べる。特に、本年度新たに同定したSla2およびEnt1タンパク質について、それぞれのタンパク質のどの部分が結合を仲介しているのか、またPan1p、Sla2p、Ent1pの機能の重複性について明らかにするために、それぞれの二重、三重機能欠失変異体を作成する。さらに、エンドサイトーシスにおけるこれら三者のタンパク質複合体形成の分子機構について明らかにする。課題③については、本年度同定したリサイクリングに関わるゴルジ体内区画の役割についてさらに詳しく解析する。特にクラスリン小胞とゴルジ体の結合を仲介するタンパク質の同定と機能解析を進める。また、今年度実施予定だったが行うことができなかった、ゴルジ体における輸送異常が膜タンパク質のリサイクリングに与える影響について、ゴルジ体の成熟とGPCRリサイクリングの関連性についても研究を進める。課題④については、Rab5の活性や局在に影響を与えるエンドサイトーシス変異体について、特に糖鎖付加に関わる遺伝子群の解析を行う。これまで、既に私達は糖鎖付加関連遺伝子6種の変異体において、GPCR輸送に異常が生じることを明らかにしており、今後はこれらの変異体を用いて糖鎖付加の標的分子の同定、さらにそれらの糖鎖付加異常がどのような機構でGPCR輸送に関わっているかについて明らかにする。
物品費が1万1千円程度残りましたが、これは購入する必要のあるものが2万円を超えるものであり、残予算額で購入できなかったためです。このため、残額については翌年度の物品費と合わせて使用する予定です。
すべて 2020
すべて 雑誌論文 (2件) (うち査読あり 2件、 オープンアクセス 2件) 学会発表 (10件)
Cancer Science
巻: 111 ページ: 4393～4404
10.1111/cas.14665
Carcinogenesis
巻: 42 ページ: 148-158
10.1093/carcin/bgaa084
