| 研究課題/領域番号 |
19K06575
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| 研究機関 | 国立研究開発法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
柊元 睦子 国立研究開発法人理化学研究所, 生命機能科学研究センター, 上級研究員 (30321756)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | X線結晶構造解析 / シグナル伝達 / Gタンパク質 / 細胞運動 / SPR / クライオ電子顕微鏡 |
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| 研究実績の概要 |
DOCKタンパク質は、低分子量Gタンパク質Rac/Cdc42のグアニンヌクレオチド交換因子(GEF)であり、これらのGタンパク質の活性化を介して細胞運動、貪食、がん転移などを促進する。DOCKの結合因子であるスカフォールドタンパク質のELMOは、DOCKによるRacの活性化を制御する分子スイッチとして機能する。本研究では、ELMOを中心としたタンパク質複合体の立体構造を解析し、ELMO-DOCK-Racシグナル伝達機構の理解と制御を目指している。
前年度は、大腸菌無細胞合成系を用いて、ヒト由来ELMO1について複数領域を発現・精製し、低分子量Gタンパク質RhoGや三量体Gタンパク質との複合体の結晶構造解析を行った。その結果、ELMO1 N末端のRas結合ドメイン(RBD)とRhoGの複合体の結晶構造の決定に成功し、ELMO1によるシグナル上流因子との新規の相互作用様式を明らかにした。
2020年度は、ELMOがDOCKのGEF活性にどのように関わるのかを明らかにするために、全長ELMO1-DOCK5-Rac1複合体の構造解析に取り組んだ。複数のタンパク質発現方法を組み合わせ、最終的にゲル濾過クロマトグラフィーによりELMO1-DOCK5-Rac1三者の安定な複合体を精製した。架橋剤で複合体をさらに安定化させ、クライオ電子顕微鏡の手法を用いた構造解析を行った結果、3.8オングストローム分解能の構造決定に成功した。得られた構造から、ELMO1 C末端のPHドメインが直接Rac1と相互作用し、DOCK5とRac1の結合を安定化していることが示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
2020年度は、ELMO1-DOCK5-Rac1複合体の構造解析を計画した。精製した試料の評価を結晶化と電子顕微鏡観察の両面から行い、最終的にクライオ電子顕微鏡を用いて構造決定に成功した。したがって概ね順調に進捗していると判断する。
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| 今後の研究の推進方策 |
ELMO1の分子スイッチ作用に関わるN末端領域は非常にフレキシブルであり、今回決定した電顕構造中では観測されなかった。今後は、RhoG等の上流因子を含むELMO1-DOCK5複合体のクライオ電顕構造解析に取り組み、活性のある状態の完全長ELMO-DOCK複合体の構造決定を目指す。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
新型コロナウイルス感染拡散防止のため、在宅勤務を推進したことにより次年度使用額が生じた。翌年度、実験に必要な消耗品に使用する。
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