| 研究課題/領域番号 |
19K06623
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| 研究機関 | 国立研究開発法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
加藤 雅紀 国立研究開発法人理化学研究所, 生命医科学研究センター, 上級研究員 (10625437)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | ノンコーディングRNA / 新生鎖RNA / クロマチン / エンハンサー / プロモーター |
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| 研究実績の概要 |
ヒトでは約28,000種のノンコーディングRNA (ncRNA)が存在するが、ほとんどの機能は明らかになっていない。いくつかのncRNAはncRNAがクロマチンに結合することで高次クロマチン構造が作り出される例が知られている。本研究ではRNAとクロマチンの相互作用を網羅的に検出する系RADICL-seq法を構築し、染色体高次構造に重要な役割をもつncRNAを探索する。またその系の応用版として、RADICL-seq法を応用した新生鎖RNAの機能解析を行う。抗RNA pol II抗体を用いライブラリーを濃縮することでエンハンサーRNAとプロモーターの相互作用の検出や、新生鎖RNAとクロマチンの相互作用を検出する系の開発を行う。本年度ではRADICL-seq法と特定の抗体による濃縮を組み合わせることによって、特定の領域を高感度で検出する系(RADICL-IP法)の開発を進めた。新生鎖RNAとその相互作用するクロマチンを効率よく濃縮するために抗RNA pol II抗体を用い、ショウジョウバエS2細胞やマウスES細胞のRADICL-seqライブラリーの途中産物から抗体pull downを行ったところ、収量面で改善する必要性がみられた。よって1) 抗ヒストン修飾抗体を用いることで収量をあげること2) プロトコールを改変することで低収量でもライブラリー作製が可能となるかを検討した。これらの検討結果によりいくつかの抗ヒストン修飾抗体ではライブラリー作製が可能となった。次世代シーケンサーMiseqを用いてライブラリーのクオリティチェックを行ったところ良好な結果が得られた。今後はHiseqを用いて大量データを取得し解析する予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
抗体を用いたRADICL-seq の応用系(RADICL-IP法)のプロトコールはほぼ完成したと思われるため
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| 今後の研究の推進方策 |
本年度はRADICL-seq 法のプロトコールの最適化を行うと共に応用系の開発としてRADICL-seq法と特定の抗体による濃縮を組み合わせることによって、特定の領域を高感度で検出する系（RADICL-IP）の開発を行った。当初、抗RNA pol II抗体を用いたが、収量面で改善する必要性がみられたため、抗ヒストン修飾抗体を用いたプロトコールを進めたところ収量が改善され、良好なライブラリーを得ることができた。今後次世代シーケンサーHiseqを用いて大量データを取得し、解析を行う。また本来の目的である新生鎖RNAとその相互作用するクロマチン、特にエンハンサー-プロモーターの相互作用に注目し解析するために抗RNA pol II抗体でもライブラリー作製が可能となるように使用する細胞数、ライブラリー調整の方法の検討を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
緊急事態宣言による在宅勤務で３ヶ月実験ができなかったことおよび当年度予定であった次世代シーケンサーによる解析が遅れたこと。よって次年度に次世代シーケンサーによる解析を行う。
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