| 研究課題/領域番号 |
19K06628
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
河口 真一 大阪大学, 生命機能研究科, 助教 (40321749)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | エピトランスクリプトーム / 塩基修飾 / 生殖幹細胞 / ナノポア / ポリA鎖長 |
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| 研究実績の概要 |
mRNAの塩基は、転写と同時期にメチル化などの様々な修飾を受けるものがあり、その後のプロセシングなどに影響する。その結果、mRNAのアイソフォームや翻訳効率が変化し、体内時計が制御される等の例が知られている。しかし、塩基修飾の機能が解明された例は少なく、多くの塩基修飾の分子機能は不明なままである。本研究の目的は、ショウジョウバエの生殖幹細胞をモデル系として、mRNAの塩基修飾による生殖幹細胞の維持と分化の制御機構を解明することである。
本年度は、対照となる培養体細胞（S2株）と成熟した卵巣を用いて、サンプル調製、及び解析システムの構築・最適化を行なった。それぞれの細胞種から、ポリA鎖をもつRNAを精製した。さらに、解析用アダプターを付加し、精製したRNAライブラリーをcDNAに変換することなく、ナノポア装置で解析した（Direct-RNA-seq）。１サンプルあたり約４８時間の分析を行い、平均1.5kb程度の長さのRNAを約50-100万分子について解析することができた。
得られた生データから、１分子毎に塩基配列を同定した。さらに、mRNAの安定性、翻訳効率に重要なポリA鎖の長さを解析した。解析にはNanopolishというプログラムを導入し、独自のスクリプトと連携させて用いた。いくつかの高発現遺伝子について、ポリA鎖長を詳しく調べたところ、ポリA鎖の短い遺伝子（平均して５０塩基程度）と長い遺伝子（平均して１５０塩基程度）が検出できた。また、塩基修飾解析用プログラム、Tomboを導入し、セットアップを行った。修飾がある塩基は、修飾がない塩基と比べて、異なる測定値を示す。ショウジョウバエのゲノム配列は、よく知られているので、修飾がない場合の期待値を推測することが可能である。解析の結果、１遺伝子あたり最大で３０程度の修飾候補部位を１塩基レベルで同定することができた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ショウジョウバエの卵巣、及び培養細胞からポリA付加mRNAを調製し、ナノポア装置を用いたDirect-RNA-seq解析を行うシステムを今年度の計画通りに構築した。ナノポア装置では、RNAライブラリーをフローセルにアプライして分析するが、解析ごとに得られるリード数が大きく異なっていた。安定して解析するためには、RNAライブラリーの品質が重要であり、サンプル調製プロトコールをさらに高精度化する必要があると思われる。
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| 今後の研究の推進方策 |
本年度は、対照となる培養体細胞（S2株）と成熟した卵巣を用いて、サンプル調製、及び解析システムの構築・最適化を行なった。次年度以降では、注目する生殖幹細胞由来のRNAを用いて解析を行う予定である。ナノポア Direct-RNA-seq解析は、比較的大量の精製mRNAを必要とすることから、希少な生殖幹細胞を解析することは困難である。野生型ショウジョウバエの場合には、卵巣中に50-100個程度の生殖幹細胞しか存在していない。そのため、生殖幹細胞を未分化な状態で増幅させるような変異株を用いる。そのような変異体から未成熟な卵巣を分取し、生殖幹細胞を集めて、解析に用いる。今年度に行なった対照群と比較して、生殖幹細胞特異的な塩基修飾候補を探索する。
ナノポア 装置から得られる生データを塩基配列に変換し、ポリA鎖長の推定、塩基修飾の検出を行う過程は、Linuxコンピュータを用いて行なっている。解析に用いるプログラムは日々進化している状況であり、常に最新の手法に対応できるようにLinuxシステムのアップデートを行う。
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