| 研究課題/領域番号 |
19K06644
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| 研究機関 | 大阪市立大学 |
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研究代表者 |
千葉 秀平 大阪市立大学, 大学院医学研究科, 講師 (60572493)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 一次繊毛 / 基底小体 / Distal appendage / 繊毛小胞 / 超解像イメージング / 移行帯 / 膨張顕微鏡法 / CRISPR/Cas9 |
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| 研究実績の概要 |
生体を構成する大半の細胞が増殖を休止させる条件で、細胞表面に非運動性の一次繊毛 (繊毛) を形成する。構造全体を被覆する繊毛膜にはCa2+透過型チャネルや各種液性因子の受容体が偏在しており、繊毛は細胞外の機械的・化学的刺激を受容するアンテナとして働く。その構造や機能の異常は発生期の形態異常、嚢胞性腎疾患、網膜変性などを複合的に呈する遺伝性疾患 (繊毛症)の発症と密接に関連することから、繊毛構築を担う分子シグナルの解明は医学的にも早急な解決が望まれる研究命題である。本研究では超解像顕微鏡と膨張顕微鏡法の併用から実現したサブナノスケールの解析手法から、繊毛形成前の母中心小体に未報告のアクチン構造を発見したことを足がかりに、その繊毛形成における役割を明らかにすることを目的とする。
本年度は、Boydenらが開発した既存の膨張顕微鏡技術の過程で行うゲル膨張、タンパク質消化処理に伴って生じる蛍光分子ラベル二次抗体の分解によるシグナル低下という解析上のボトルネックを新たなシグナル増強技術であるAmplibody法の導入により打破した。Amplibody法によって調製した膨張顕微鏡法サンプルは既存の方法と比較し、シグナル輝度が増強され安定な超解像イメージングが可能となった。この方法を駆使して、中心小体と繊毛関連分子の空間配置解析を行い、繊毛形成に重要な親中心小体上の付属構造体であるDistal appendage構成分子が示す9回対称性パターンの局在を明確に示すことに成功した。さらに、マルチカラー超解像イメージングにより、繊毛形成過程における繊毛内輸送(IFT)複合体の構成分子であるIFT88のダイナミックな局在変化を明らかにした。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
これまでに以下の課題に取り組んだ。
(1) 膨張顕微鏡法と超解像顕微鏡の併用により、基底小体ならびに一次繊毛の超解像イメージング技術を確立し、論文として発表した (Katoh et al. (2020) MBoC). (2) 上述の超解像イメージング解析を駆使し、繊毛形成過程における移行帯分子の動態と空間配置を明らかにし、その構築を担う制御メカニズムの一端を明らかにした。本年度中の投稿に向け、現在準備中である。(3)研究計画に基づき、繊毛形成過程におけるアクチン動態制御ならびに繊毛小胞の形成に関わると想定された各種遺伝子についてノックアウト細胞株を作製した。2021年度中に当該遺伝子産物の繊毛形成における役割の詳細を明らかにすることを目指している。
当初の研究計画通り、膨張顕微鏡法と超解像顕微鏡の併用によるイメージング技術を構築し、当該課題を論文として発表した。また、構築したイメージング技術を駆使し、繊毛の構造と機能の構築において重要とされる移行帯の制御メカニズムについても近々発表見込みであるため、本研究課題は概ね順調に進展していると評価している。
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| 今後の研究の推進方策 |
以下の課題について重点的に進める。
(1) 一次繊毛の形成ならびに機能構築に重要と考えられる移行帯の繊毛形成過程での詳細な役割や移行帯構築を制御する分子システムについては不明な点が多い。そこで、CRISPR/Cas9法によって構築した各種繊毛形成関連分子のノックアウト細胞株の繊毛構築過程、移行帯構築プロセスを本年度構築したイメージング法によって詳細に観察し、上記の問題を明らかにする。
(2)繊毛形成のごく序盤に基底小体近傍のPI(4,5)P2のレベルを調節することが報告されているPIPKIgammaとINPP5Eが、Distal actin動態に影響すると想定し、PIPKIgammaとINPP5EのKO細胞を作製し、活性変異体や中心体局在化ドメインを欠いた変異体を導入したKO細胞内でDistal actinの動態変化の解析を行い、繊毛構築過程での中心体近傍でのアクチン制御シグナルの実体解析を行う。
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| 備考 |
膨張顕微鏡法とAiryscan型超解像顕微鏡を用いた中心体、繊毛の超解像イメージング技術がCarl Zeiss Web pageにて紹介された。
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