| 研究課題/領域番号 |
19K06669
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| 研究機関 | 国立研究開発法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
戸島 拓郎 国立研究開発法人理化学研究所, 光量子工学研究センター, 上級研究員 (00373332)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 成長円錐 / ゴルジ体 / カルシウム / 軸索ガイダンス / 生細胞イメージング |
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| 研究実績の概要 |
ゴルジ体はタンパク質の翻訳後修飾や選別輸送を司る膜交通（membrane traffic）のキーステーションである。小胞体やミトコンドリアと同様に、ゴルジ体には高濃度Ca2+が内蔵されているが、その役割については不明の点が多い。本申請課題では、特に神経回路形成時の神経軸索ガイダンスに焦点を当て、ゴルジ体Ca2+シグナルが生命機能に果たす役割を解明する。具体的には、ゴルジ体内腔Ca2+が積荷タンパク質の糖鎖修飾や選別輸送を制御したり、細胞質Ca2+シグナル発生のための供給源として働く可能性などについて検証してゆく。
平成３１年度は、ゴルジ体内腔Ca2+プローブの作製とその性能評価を行った。ゴルジ体はシス、メディアル、トランス、トランスゴルジ網（TGN）といった４種類の槽から成るが、これら各ゴルジ槽局在配列を低親和性Ca2+感受性プローブに融合し、ゴルジ体内腔にCa2+感受性プローブが呈示されるコンストラクトを作製した。これらをHeLa細胞に発現させ、ヒスタミン刺激を与えたところ、典型的な応答例として、細胞質Ca2+濃度変動とは逆位相のシグナル変動が観察された。すなわち、ゴルジ体内腔のCa2+が細胞質にリリースされうることが示唆された。興味深いことに、まだ予備実験の段階ではあるが、ゴルジ体とTGNではヒスタミンに対するCa2+応答性が異なっている可能性が示唆された。また、Ca2+ポンプ阻害剤の投与実験にも着手した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
上述のように、各種新規ゴルジ体／TGN内腔Ca2+プローブのセットが完成し、性能評価の結果も良好であったため。
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| 今後の研究の推進方策 |
令和２年度は、完成したゴルジ体内腔Ca2+プローブを用いて、下記のような実験に取り組む。（１）微細ガラスピペットにより成長円錐にのみ軸索ガイダンス因子を作用させた際のゴルジ内腔Ca2+変動と、それに連動した積荷輸送・糖鎖付加の動態を解析する。積荷輸送は、RUSHシステムを用いて様々な種類の積荷タンパク質（神経接着分子や神経栄養因子受容体など）をパルスチェイスする。（２）作製したゴルジ局在型Ca2+プローブと、細胞質Ca2+プローブを成長円錐に共発現させ２色同時観察を行う。これにより、ゴルジ体内腔Ca2+濃度の減少に伴って近傍の細胞質Ca2+濃度上昇が観察されれば、成長円錐においてゴルジ体がCa2+ストアとして働くことの状況証拠になる。小胞体局在型Ca2+感受性プローブを用いて同様の実験も行い、ゴルジ体由来Ca2+放出と小胞体由来Ca2+放出との時空間動態の違いを検証する。
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