| 研究課題/領域番号 |
19K06670
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| 研究機関 | 国立研究開発法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
小川 泰 国立研究開発法人理化学研究所, 開拓研究本部, 研究員 (70624956)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 核細胞質間輸送 / 熱ストレス / 核画分分画法 |
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| 研究実績の概要 |
ヒトを含む多くの生物の細胞は、非常に狭い温度領域において、恒常性や増殖能を維持している。熱ストレスなど、その温度領域を外れると、細胞は様々な分子応答を介して、このタンパク質毒性環境に対応する。最近、申請者は、細胞の機能維持に必須である核-細胞質間輸送システムが温度上昇に対し、段階的に調整されることを発見し、その中で輸送因子importin αファミリーの熱変性が大きな役割を果たすことを見出した。他のシグナル経路依存的な応答ではなく、importin αが直接温度を感知し輸送を制御することは、様々なストレス応答の根幹部分で、重要な働きがあると考えられる。また、熱ストレス応答に関して、多くの研究が進められている転写因子HSF1とそれにより発現誘導される分子シャペロンHSP70とは、独立した応答機構であることから、新規の細胞核の機能が明らかになると期待される。また、予備実験として、ヒトより体温の高いニワトリではimportin αファミリーの変性温度が上昇することを発見した。本研究では、まずimportin αファミリーの熱感受性によって局在が変化する核タンパク質の網羅的同定を試みた。ヒトまたはニワトリ由来のimportin αファミリーを発現する細胞株を用いて、43℃における核タンパク質のiTRAQ法による網羅的比較定量分析を行ったが、ほとんど違いは見出せなかった。これは、今回用いた従来の核タンパク質の分画法では、局在が変化することが期待される可溶性核タンパク質の多くが失われることに起因すると考えられた。そこで、細胞膜に豊富なコレステロールに特異的な界面活性剤であるDigitoninを用いた新規の核画分の分画法を開発した。この方法を用いると、可溶性核タンパク質群を高効率で短時間に取得できることができるようになった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
まず、変性温度がヒトimportin αよりも2～3℃高いニワトリimportin αを発現誘導できる細胞株を樹立した。より低温で変性するimportin αの役割を明らかにするために、ヒトまたはニワトリimportin αを発現誘導した細胞を43℃の熱ストレス条件下で1時間培養し、核内に存在するタンパク質を網羅的に比較定量した。しかし、市販の核タンパク質の分画キットでは、ダイナミックに核と細胞質間で局在変化する可能性のある可溶性核タンパク質の多くを失ってしまった。そこで、新規の核画分の取得方法の確立を試みた。細胞膜に豊富なコレステロールに特異性のある界面活性剤Digitoninを用いた細胞膜透過処理方法を改良し、より高濃度の可溶性核タンパク質を得ることができるようになった。本方法は、1.5mlチューブのスケールで質量分析に必要十分な量の核タンパク質が得られることから、多条件での実験にも適している。当初の計画よりも遅れる結果になったが、より高精度の核画分の取得が可能になったことから、概ね順調に進展しているといえる。
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| 今後の研究の推進方策 |
今年度、確立した新規の分画方法を用いて、温度上昇に従って局在を変化させる核タンパク質を同定する。そのために、様々な温度で培養した細胞から核タンパク質を抽出し、iTRAQ法で網羅的比較定量分析を行う。一方で、それぞれのタンパク質が、各温度で変性した割合も決定していく。これら２つの情報から、機能を維持したまま局在を変化させるタンパク質の温度閾値を決定していく。温度閾値ごとにグループ化し、核-細胞質間輸送経路との関係性を明らかにする。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当初は、温度上昇に伴い、局在が変化する核タンパク質のプロテオミクス解析を行う予定であったが、既存の核画分の取得方法では十分な結果が得られないことが判明した。そこで、予定を少し変更し、初年度は、主に新規の核画分の取得方法の確立に注力した。そのため、当初予定していたプロテオミクス解析の一部は次年度に持ち越すこととなり、初年度の使用額が少なくなった。
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